Le rôle de l’oncoprotéine INT6 dans la maintenance des télomères

Mécanismes de réparation des télomères

Une fois que la signalisation des cassures est effective, la réparation des télomères se met en place. En règle générale, quatre principales voies de réparation de l’ADN existent : la réparation par excision du nucléotide (NER pour Nucléotide Excision Repair), la réparation par excision de base (BER pour Base Excision Repair), la réparation des mésappariements (MMR pour MisMatch Repair) et enfin la réparation des cassures double brin qui comprend la recombinaison homologue (RH pour Homologous Recombination) et la recombinaison non homologue (NHEJ pour Non Homologous End Joining). Les deux derniers mécanismes sont ceux qui interviennent au niveau des télomères. En effet, l’activation des deux kinases ATM ou ATR (en fonction du dommage) conduit à la phosphorylation et à l’activation des régulateurs du cycle cellulaire p53, CHK1 et CHK2 qui facilitent l’arrêt en phase G1 et G2 permettant la réparation par le HR ou NHEJ (Khanna and Jackson, 2001). Actuellement, on ne sait pas très bien, quels sont les facteurs qui déterminent l’utilisation d’un mécanisme plutôt que l’autre, mais le stade du cycle cellulaire jouerait un rôle important dans cette décision. En effet, la RH est possible uniquement en phase S et G2 car elle nécessite un deuxième brin matrice. De plus, les CDK (Cycline-dependent Kinases) régulateurs de la progression du cycle cellulaire sont capables de moduler les deux mécanismes (Esashi et al., 2005; Konishi and de Lange, 2008).

Réparation des télomères par le NHEJ

Le NHEJ est présent dans les cellules de mammifères et est opérationnel durant toutes les phases du cycle cellulaire (Kim et al., 2005a; Rothkamm et al., 2003). Il se manifesterait aux 46 télomères suite à l’absence de la télomérase ou d’un facteur shelterin. Le mécanisme suit le même déroulement que dans le reste de la cellule, c’est-à-dire : l’hétérodimère Ku70/80 fixe les extrémités double brin au niveau de la cassure, puis, recrute la DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) qui interagit avec l’ADN fixé à Ku pour former les complexes DNA-PKcs. Cette association assure le maintien des extrémités dans une configuration permettant leur ligation par XRCC4/Ligase IV après avoir phosphorylé XRCC4 (Leber et al., 1998). Le recrutement de l’endonucléase XRCC4/XLF assure aux sites déprotégés la dégradation du brin sortant en 3’, une étape essentielle à la mise en place des fusions télomériques (Zhu et al., 2003) (figure 16). Cependant, une hypothèse de l’existence d’un mécanisme NHEJ indépendant de Ku subsiste, ceci est dû à des observations de fusions télomériques en absence de Ku qui s’accompagneraient de raccourcissement de télomères (d’ Adda di Fagagna et al., 1999). Figure 16. Représentation schématique des deux voies de réparation NHEJ et HR. 47 b. Réparation des télomères par le RH Cette voie moins fréquente, est la plus souvent utilisée pour réparer des cassures en S/G2. Elle nécessite l’appariement d’un fragment d’ADN avec une séquence homologue servant de matrice à la séquence réparatrice. Les échanges entre chromatides-sœurs (T-SCE) au niveau télomérique sont surtout présents dans les cellules ALT (Bailey et al., 2004a; Bechter et al., 2004). Ces échanges pourraient être des réactions accessoires de la recombinaison homologue pour allonger les télomères ou bien la conséquence d’une réponse au dommage à l’ADN. Dans la cellule, en règle générale c’est le complexe MRN qui agit comme effecteur de la recombinaison en réalisant la résection des extrémités des cassures double brin qui sont ensuite maturées afin de générer les simples brins nécessaire à la recombinaison (figure 16). Ensuite, les protéines RAD52 et RPA se fixent sur les extrémités pour faciliter le recrutement de la protéine RAD51 en éliminant les structures secondaires de l’ADN (Baumann and West, 1997; Golub et al., 1998; Kurumizaka et al., 1999). Une extrémité 3’ de la molécule lésée envahit la molécule duplex homologue et s’apparie au brin matrice. La protéine RAD51 peut alors se fixer sur les extrémités d’ADN simple brin ainsi générées. Par la suite le processus synaptique se met en place : premièrement, la recherche d’homologie entre l’ADN simple brin et le duplex, puis, l’appariement des brins et enfin, l’échange de brins qui initie la formation de l’hétéroduplex. Sous le contrôle de BRCA1 et BRCA2, RAD51 recherche la séquence correspondante sur le chromosome homologue pour ensuite envahir l’autre brin. Cette invasion de brins est facilitée par la protéine Rad54 (Golub et al., 1997; Mazina and Mazin, 2004). En effet, cette protéine forme des enroulements négatifs au niveau du duplex qui facilite l’accès et l’invasion de brins. Pour aboutir à un échange de brins complets, l’hétéroduplex formé est étendu. L’extension de l’hétéroduplex peut se faire de deux façons, soit la protéine RAD51 continue l’échange de brins avec une polarité 5’ vers 3’ par rapport au brin déplacé : l’échange de brins est donc unidirectionnel, soit l’extension de l’hétéroduplex est assurée par la migration de la jonction de Holiday formée par l’initiation d’échanges de brins (figure 16). Un télomère fonctionnel requiert la machinerie de reconnaissance des dommages à l’ADN pour une réplication efficace des répétitions télomériques, la mise en forme de l’extrémité après la réplication et la formation de la coiffe protectrice. Un télomère dysfonctionnel requiert cette même machinerie pour être détecté comme tel et pour le préparer à être réparé. Les protéines de la machinerie de la RH assurent donc un double rôle aux télomères. Le 48 complexe MRN intervient dans le maintien des télomères à travers la voie de recombinaison homologue, il est de plus, requis pour la mise en forme des télomères après la réplication mais aussi dans la détection et signalement des cassures double brin. La protéine TRF2 inhiberait l’activité MRN en empêchant sa fixation (Dimitrova and de Lange, 2009). Les deux autres protéines RAD51 et BRCA2 agissent avec le complexe MRN afin de permettre aussi la maintenance des télomères par l’intermédiaire de la voie de la recombinaison homologue. En effet, les travaux chez la souris ont montré que l’absence de l’une de ces deux protéines induit le raccourcissement des télomères avec augmentation des signaux télomériques de type MTS (Multiple Telomere Signals), qui sont une marque de fragilité associée à la réplication (Badie et al., 2010). Par contre, la protéine KU déjà mentionnée pour avoir un rôle dans le NHEJ, serait aussi responsable de l’inhibition d’évènements de réparation inappropriées aux télomères (Fisher and Zakian, 2005; Fisher et al., 2004). La protéine semble être un inhibiteur de la RH aux télomères avec l’aide de TRF2 car l’inhibition conjointe de ces protéines augmenterait le nombre d’évènements de T-SCE (Celli et al., 2006). Une autre possibilité d’intervention d’évènement de la RH est la perte d’expression de TRF2. En effet, l’expression d’une protéine mutante de TRF2 dans les cellules induit une perte rapide des télomères et la formation de cercles chromosomiques télomériques (Wang et al., 2004). Ce raccourcissement serait dépendant des protéines XRCC3 et NBS1 impliquées dans la RH. Ceci suggère l’importance de TRF2, en plus du reste des shelterin dans la protection des télomères contre la recombinaison homologue inappropriée. 

LA PROTEINE 

Découverte

La découverte du gène int6 remonte aux années 1995, lors de recherches sur l’intégration du virus MMTV. Le MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) est un rétrovirus oncogène de la souris, induisant la transformation et l’expansion clonale des cellules infectées. L’observation des souris infectées a révélé 6 loci d’intégration du virus, nommés int pour site d’intégration: int1/wnt1, wnt3, wnt10B, int2/fgf3, fgf4 et int6 (Tekmal and Keshava, 1997). Le virus s’intègre dans certains introns du gène int6, générant la synthèse d’ARNm tronqués. Il a été montré que les protéines Int6 codées par ces ARNm tronqués sont oncogènes chez la souris (Marchetti et al., 1995). II. Int6/INT6 Le gène int6 humain, dont le produit est aussi connu sous les noms ; EIF3E, EIF3S6, EIF3- P48, eIF3-p46, LOC3646 ou moyshoy, PCI.3, est localisé sur le chromosome 8 avec une taille de 254kb. Il est conservé au cours de l’évolution, de la levure (chez S. pombe) à l’humain, suggérant son importance pour la cellule. Le gène code pour une protéine ubiquitaire de 48kDa. Elle possède une localisation aussi bien cytoplasmique que nucléaire car elle est pourvue à la fois d’une séquence d’export nucléaire NES (« Nuclear Export Sequence ») et d’un signal de localisation nucléaire NLS (« Nuclear Localisation Signal »), ce qui est caractéristique des protéines navettes (Guo and Sen, 2000) (figure 17). De plus, INT6 contient un domaine particulier, nommé PCI pour ProteasomeCOP9 signalosome (CSN)-Initiation of translation (Hofmann and Bucher, 1998; Lee et al., 2011), retrouvé dans plusieurs sous unités du protéasome, du signalosome COP9 (constitutive photomorphogenesis 9) et du facteur d’initiation de la traduction eIF3. Le domaine PCI existe donc dans des sous-unités de complexes intervenant dans : la dégradation de protéines, la régulation des E3 ubiquitine ligase de type SCF et la traduction d’ARNm, respectivement. Si, INT6 a été caractérisée comme une sous-unité de eIF3, elle a aussi été montrée qu’elle interagissait avec le protéasome 26S et le COP9 signalosome (Hoareau Alves et al., 2002; Karniol et al., 1998; Yahalom et al., 2001; Yen and Chang, 2003). Par exemple, INT6 lie la protéine Rpt4 qui est l’une des six AAAs qui forment la base de la particule 19S et déploient 50 les protéines pour être dégradé par le protéasome. La perte de ce domaine (PCI) pourrait perturber les fonctions d’INT6 car l’intégration du MMTV tronque la protéine INT6 qui perd ainsi son domaine. Ceci révèle un rôle probable d’INT6 en tant que protéine régulatrice qui coordonne l’activité des trois complexe ; protéasome, CSN et eIF3. Chez les mammifères, INT6 est largement exprimée ; un transcrit de 1,6kb est retrouvé dans le cerveau, poumon, cœur, foie, rate, pancréas, muscle squelettique, ganglions lymphatiques, glandes mammaires et thymus (Desbois et al., 1996). Cependant, l’analyse par Northern blot révèle des niveaux d’expression variables. Le plus haut niveau a été retrouvé au pancréas, muscles et tissus lymphatiques. Figure 17. Représentation de la protéine INT6 et ses domaines fonctionnels. III. Fonctions d’INT6 1. INT6 et tumorigenèse En ce qui concerne son rôle dans le développement de tumeurs, le sujet reste ouvert (Buttitta et al., 2005; Chen et al., 2007; Marchetti et al., 2001; Rasmussen et al., 2001) car il est impossible de générer des modèles animaux avec une absence d’expression de la protéine (Knock-down). Les essais faits sur la souris et la drosophile se sont révélés létaux pour leurs survies (Rencus-Lazar et al., 2008). Néanmoins, des pistes de son implication dans le développement tumoral existent. INT6 serait un suppresseur de tumeur : la surexpression d’une forme d’INT6 tronquée de sa moitié Cterminale induit la transformation de lignées cellulaires murines et humaines (Mayeur and Hershey, 2002; Rasmussen et al., 2001), la synthèse d’INT6 tronquée par l’insertion du MMTV, au niveau des glandes mammaires, induit l’hyperplasie et la formation tumorale (Mack et al., 2007). Il y a aussi l’évidence qu’INT6 est impliquée dans la transition des cellules épithéliales à mésenchymateuses (EMT), un évènement important au cours de l’embryogénèse mais aussi dans la tumorigenèse. En effet, ce changement peut induire des métastases, permettant aux cellules d’acquérir des propriétés migratoires. Il a été montré que 51 l’expression d’INT6 dans les cellules épithéliales du sein affecte l’expression de Snail et Zeb2, deux régulateurs de l’EMT et de l’apparition de métastases (Gillis and lewis, 2013). De plus, une diminution du niveau de l’ARNm int6 est observée dans 27% des carcinomes pulmonaires ; cet événement constituant un indice de mauvais pronostic (Buttitta et al., 2005). INT6 peut aussi cibler la dégradation du facteur d’hypoxie : Hypoxia Induced Factor 2 alpha (HIF-2α), supprimant alors l’induction de facteurs angiogéniques (Chen et al., 2007, 2010). Selon Okamoto, un traitement avec des siRNA INT6 pourrait être une thérapie pour promouvoir l’angiogénèse et le recouvrement des artères (Okamoto et al, 2011 ; Miyashita et al, 2012). Par contre, des études ont rapporté qu’INT6 pouvait être oncogène : le traitement de cellules cérébrales par siRNA INT6 induit l’apoptose des tumeurs gliales et l’inhibition du cycle cellulaire entrainant une diminution de la prolifération des glioblastomes (Sesen et al., 2014) et la surexpression d’INT6 agirait sur la traduction d’ARNm impliqués dans la croissance tumorale ; ARNs impliqués dans l’invasion et l’inhibition d’apoptose tel que l’activateur plasminogène type urokinase (PLAU) et le régulateur apoptotic BCL-XL (Grzmil et al., 2010). Si l’implication d’INT6 dans les cancers reste mal connue, plusieurs observations indiquent que l’altération qualitative ou quantitative de cette protéine a des effets tumorigènes. 2. INT6, facteur d’initiation de traduction En 1997, INT6 a été identifiée comme sous unité « e » du facteur eucaryote d’initiation de traduction eIF3 (Asano et al., 1997). Chez les mammifères, eIF3 est considéré comme étant le plus grand facteur d’initiation avec une taille avoisinante les 800 kDa. Il est constitué de 13 protéines chez l’homme, qui sont consécutivement appelées eIF3a-m (Browning et al., 2001; Zhou et al., 2008). eIF3 dirige les interactions entre l’ARNm, la sous-unité ribosomale 40S et l’initiateur Met-tRNA, pour permettre l’initiation de la traduction. Il fonctionne comme plateforme pour les interactions avec d’autres régulateurs eIFs (Hinnebusch, 2006). Chez les levures à bourgeonnement, eIF3 comprend un cœur de 5 sous-unités, requis pour la traduction générale (Asano et al., 1998; Phan et al., 1998). Chez ce type de levures ne comprend pas la protéine eIF3e/INT6, mais a plutôt une autre protéine étroitement ressemblante nommée Pci8p (Shalev et al., 2001). Par contre chez la levure s.pombe, eIF3 comprend un homologue d’INT6 appelé Yin6. 52 Des travaux effectués chez cette levure avec des mutants de Yin6 afin de caractériser sa fonction, montrent une faible diminution du taux des protéines synthétisées et des polysomes (Akiyoshi et al., 2001; Bandyopadhyay et al., 2000; Zhou et al., 2005). De plus, chez cet organisme, des travaux ont rapporté la présence de deux complexes eIF3 distincts : l’un d’eux défini par la sous-unité Csn7Bp/eIF3m qui parait être responsable de la traduction d’une majorité d’ARNm, alors que le deuxième complexe comprenant INT6 semble être associé à la régulation d’un nombre restreint d’ARNm (Zhou et al., 2005). En ce qui concerne les mammifères, INT6 forme probablement une organisation similaire avec les sous-unités a, b, c, f et h mais en contraste avec les autres, elle est non essentielle pour la traduction générale. Cependant, il a été découvert qu’INT6 était requis pour la dégradation des ARNm avec un codon stop prématuré car son extinction inhibe le NMD (Morris et al., 2007). Alors que l’inhibition de eIF3l, un facteur eIF3 associé à INT6, n’a aucun effet sur le NMD (MorrisDesbois et al., 2001). Il a aussi été rapporté qu’INT6 agissait positivement sur des ARNm impliqués dans la coagulation, l’endocytose et le rôle de navette et négativement sur des gènes contrôlant la division cellulaire et l’adhésion (Grzmil et al., 2010).