Extraction des HE par hydrodistillation

Méthode chimique

La partie chimique comprend l’extraction des HE par hydrodistillation sur un appareil de type Clevenger, et l’identification de la composition chimique des HE par un chromatographe en phase gazeuse équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (CPG/DIF). I.1.1. Extraction des huiles essentielles Elle est effectuée à l’aide d’un distillateur de laboratoire (figure 7). L’appareillage comporte les éléments suivants : – un autocuiseur modifié, – un essencier, – un réfrigérant ascendant pour la condensation de la vapeur contenant le mélange HE-Eau.  Les autres matériels et appareils utilisés pour l’extraction des HE sont : – Tubes à essai, – Flacons teintés et hermétiquement fermés, – Balance de précision, – Balance de précision METTLER® PE163, – Centrifugeuse Sigma 302-K. L’extraction de toutes les HE, objet de cette étude, est faite par hydrodistillation à l’échelle de laboratoire [32, 33]. C’est une méthode d’extraction dont le rôle est d’entraîner les composés volatiles des produits naturels avec la vapeur d’eau. Apres pesage des matériels végétaux, on porte à ébullition un mélange eau dans laquelle est plongé le matériel végétal durant trois heures [34, 35] ; les cellules du végétal éclatent et libèrent alors les espèces chimiques odorantes qui sont entraînées par la vapeur d’eau, puis récupérées dans un autre récipient après condensation. L’hydrodistillat obtenu est constitué de deux phases non miscibles, une phase inférieure aqueuse et une phase supérieure organique constituée par la HE. La HE récupérée est ensuite stockée à 4°C dans des vials de couleur brune hermétiquement fermés à l’abri de la lumière jusqu’à son utilisation, ceci afin d’éviter toutes réactions susceptibles de modifier la composition de l’extrait.

Identification de la composition chimique des HE sur CPG/DIF

Chromatographe en Phase Gazeuse équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (CPG/DIF) De manière simplifiée, un appareil CPG/DIF comprend une source de gaz vecteur, une chambre d’injection, un four dans lequel sont placés une colonne capillaire, un détecteur DIF et un système d’acquisition des données.  Figure 8 : schéma général d’un chromatographe en phase gazeuse (CPG) couplé à un détecteur à ionisation de flamme (DIF) http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/imgArt/chromato/chromato_gaz1.html consulté le 20 mars 2013 Le mélange à analyser est vaporisé à l’entrée d’une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire ; ce mélange est transporté à travers la phase stationnaire à l’aide d’un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres selon leur temps de rétention. Le principe de la séparation repose sur la différence d’affinité des composés pour la phase mobile et pour la phase stationnaire. Un composé qui a plus d’affinité pour la phase mobile, aura moins d’interaction avec la phase stationnaire et sera ainsi élué plus rapidement. A l’inverse, un composé ayant plus d’affinité pour la phase stationnaire sera retenu par celle-ci et mettra beaucoup plus de temps avant de sortir de la colonne. Chaque composé sorti est analysé par un détecteur. Ce détecteur évalue en continu la quantité de chacun des constituants séparés au sein du gaz porteur grâce à la mesure de différentes propriétés physiques du mélange gazeux et envoie un signal électronique vers un enregistreur. Les analyses des échantillons des HE dans notre étude sont effectuées au moyen d’un CPG (GC TRACE 1300) équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (DIF) lui-même équipé d’un injecteur automatique AI 1310. L’appareil est piloté par le logiciel ChromCard. 22 La séparation des constituants est effectuée sur une colonne capillaire Rtx-WAX, en silice fondue, contenant une phase stationnaire en polyéthylène glycol. Le gaz vecteur utilisé est l’hydrogène. Un volume de 1µl de HE à 1% diluée dans l’hexane (PROLABO lot : 11Z3009) est injecté pour l’identification [38]. La CPG/DIF est une méthode chromatographique qui permet de séparer des molécules dans un mélange très complexe comme HE ; la CPG s’applique principalement aux analyses des composés volatiles. La nécessité de maintenir les molécules à l’état gazeux implique donc que toute l’opération chromatographique se réalise à une température compatible avec cet état sans provoquer leur destruction [39]. Le laboratoire LCQSP de l’IMRA utilise les Esters Méthyliques d’Acide Gras (EMAG) constitués de C5 à C25 à la place des alcanes linéaires comme produits de références pour calculer les indices de rétention (IR) [40] ; L’IMRA a constitué une banque de données à partir des différentes analyses de HE et témoins effectués par son laboratoire depuis sa création, les études de reproductibilités qu’il a effectuées ont permis de montrer que ces indices d’EMAG notés I(x) ne présentent aucune variation significative par rapport aux divers facteurs [26]. Conditions opératoires de l’analyse sur CPG : – le gaz vecteur est sous une pression constante de 33 Kpa (ou 0,33 bar) en tête de la colonne, – la colonne utilisée a une longueur de 30 m, un diamètre interne de 0,32 mm, et l’épaisseur du film est de 0,25 µm, – la température du four est un gradient allant de 50°C à 250°C à raison de 5°C/min, – les détecteur et injecteur sont maintenus à 255°C, – le volume d’injection est fixé à 1µl, en mode split 1/75. Les différentes étapes de l’identification des composants consistent successivement à : – injecter les esters méthyliques d’acide gras (C5 à C25) – injecter 1µl d’échantillon à analyser – calculer l’indice d’ester I(x) de chaque pic détecté sur le chromatogramme selon la formule décrite par Tilquin .