Impact de l’infection par le Cytomégalovirus sur les petites vésicules extracellulaires trophoblastiques et conséquences sur les cellules fœtales

Article « Le Cytomégalovirus humain modifie la sécrétion et la composition des petites vésicules extracellulaires trophoblastiques, favorisant ainsi l’infection des cellules fœtales receveuses »

Les sEV trophoblastiques exercent un effet antiviral au cours d’une grossesse physiologique, et les infections virales peuvent moduler la sécrétion, la composition ainsi que les fonctions biologiques des sEV. Dans ce contexte, grâce à un modèle de cellules trophoblastiques HIPEC, nous avons évalué l’impact de l’infection par le hCMV sur la sécrétion et la composition des sEV trophoblastiques ainsi que les impacts fonctionnels de ces sEV trophoblastiques. Ce travail est présenté dans l’article joint intitulé « Le Cytomégalovirus humain modifie la sécrétion et la composition des petites vésicules extracellulaires trophoblastiques, favorisant ainsi l’infection des cellules fœtales receveuses », actuellement en cours de relecture par les collaborateurs avant soumission à l’hiver. Dans cet article, et de manière similaire aux descriptions obtenues dans d’autres types cellulaires, nous avons montré que l’infection par le hCMV augmente le taux de sécrétion des sEV trophoblastiques, qui présentent par ailleurs une taille relative réduite. (Streck et al., 2020) Concernant la composition protéique des sEV, nos données de protéomique ont mis en évidence que leur profil protéique est modifié au cours de l’infection. Nous avons décrit que l’infection par le hCMV induit des modifications d’expression de protéines cellulaires, notamment de protéines impliquées dans les voies d’autophagie et de réponse immunitaire, et d’autre part un enrichissement en protéines virales du hCMV. Ces protéines des sEV, virales et cellulaires, pourraient exercer sur des cellules naïves distantes un effet de facilitation d’une infection future à hCMV. Nous avons donc analysé l’impact de ces sEV trophoblastiques modifiées sur la permissivité virale de fibroblastes fœtaux et de cellules souches neurales. Nous avons tout d’abord validé que les cellules fœtales internalisent les sEV trophoblastiques de manière temps et dose dépendante. Par la suite, nous avons montré que l’incubation des cellules fœtales avec des sEV issues de cellules trophoblastiques infectées par le hCMV augmente significativement le taux d’infection par rapport à une condition contrôle avec des sEV de cytotrophoblastes non infectés. Cette facilitation de l’infection dans les cellules souches neurales naïves a également été retrouvée avec des sEV issues de placentas précoces infectés par le hCMV ex vivo et avec des sEV issues de liquide amniotique de patientes enceintes en séroconversion hCMV.

Virus production, titration and infection

The endotheliotropic VHL/E strain of hCMV – a gift from Dr C. Sinzger, University of Ulm, Germany – was used in this study [39]. Viral stocks were obtained upon amplification of the virus on MRC5 cells and concentrated by ultracentrifugation, as already described [14]. Virus titration was realized by indirect immunofluorescence against the Immediate Early (IE) antigen of hCMV, upon infection of MRC5 cells by serial dilutions of the viral stock [14]. In some experiments, virus titration was also performed by qPCR from cell culture supernatants [40]. To purify sEVs from infected cells, 4 million cytotrophoblasts were seeded in 150 cm2 flask, with 6 flasks per condition. 24 h later, cells were infected or not by hCMV at multiplicity of infection (MOI) of 10 (Supplementary Figure 1A). Culture medium was replaced by Exofree medium 24 h post-infection, after having previously ensured that this did not affect the cell growth (Supplementary Figure 1B). Culture supernatants were collected at 48 h and 72 h post- infection, times at which 50-80 % of cells were infected as assessed by IE immunofluorescence (Supplementary Figure 1C). Medium were pooled for each condition (non-infected or infected) and submitted to sEV preparation protocol. Cell number at the end of the experiment was determined by counting upon trypsinization and cell viability evaluated by trypan blue.

Procedures were realized as described previously [36], according to ISEV guidelines [41]. All steps were performed at 4 °C and PBS solution was filtered on a 0.22 m filter. A preclearing centrifugation of the conditioned medium was carried out for 30 min at 1,200 g to eliminate dead cells and large debris, followed by a second ultracentrifugation for 30 min at 12,000 g (rotor SW32Ti, with maximal acceleration and brake) to eliminate large EVs (principally microvesicles) and the majority of viruses. A last ultracentrifugation was done for 1 hour at 100,000 g (Rotor SW32Ti, with maximal acceleration and brake) allowing to pellet sEVs. The pellet was resuspended either in 100 μl PBS or in diluent C (Sigma) for PKH67 staining of the vesicles (Sigma), according to the manufacturer’s instructions (5 min incubation; 1:1,000 dilution). Pellet was diluted in a solution of 40 % iodixanol in sucrose before ultracentrifugation on a discontinuous iodixanol/sucrose gradient (10 to 40 % iodixanol) with deposition of the sEVs on the bottom of the tube, during 18 h at 100,000 g (rotor SW41Ti, acceleration 5, no brake), to separate sEV from remaining viruses [34, 36, 42]. Six fractions of 1.7 ml were collected, fractions 2+3 were pooled and washed in 25 ml PBS. After a last ultracentrifugation for 1 h at 100,000 g (Rotor SW32Ti, with maximal acceleration and brake), the sEV pellet was resuspended in PBS, aliquoted and stored at -80 °C. We submitted all relevant data to the EV- TRACK knowledgebase (EV-TRACK ID: EV210154) and obtained an EV-METRIC score of 100 % for trophoblast and placental explants EVs.