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MATERIELS ET METHODES

MATERIEL D’ETUDE

Pour la présente étude, le but a été d’obtenir des échantillons de miels présumés de litchi de provenance géographique et de date de récolte connues. Les miels ont été récoltés par les apiculteurs après la période de miellée.
Au total, 31 échantillons de miels ont pu être collectés. Le tableau 2 montre la liste des échantillons avec la référence, le lieu et la date de récolte, ainsi que le mode d’obtention des miels.
Les échantillons de miels présumés de litchi proviennent de Manakara, Vohipeno (Vatovavy Fitovinany), Farafangana (Atsimo Atsinanana) et Fénérive Est (Analanjirofo). Les échantillons de Vatovavy Fitovinany et d’Atsimo Atsinanana ont été regroupés dans l’appellation sud-est. Tous les échantillons étant des miels de l’est de Madagascar, ceux du sud-est ont été désignés LSE et ceux de Fénérive Est, LF.
Pour les références, les échantillons ont été classés suivant leur milieu de provenance et numérotés selon leur date d’arrivée au laboratoire. Ainsi, les échantillons de Vatovavy Fitovinany et d’Atsimo Atsinanana ont été notés LSE1 à LSE19 et ceux d’Analanjirofo, notés LF1 à LF12.
Les échantillons de miels présumés de litchi ont été récoltés en 2009 et en 2010, pour la plupart au mois d’octobre. Le mois de récolte n’a pas pu être obtenu pour certains échantillons.
Les 31 échantillons de miels ont été obtenus de différentes manières :
– 20 échantillons achetés auprès des apiculteurs (A),
– 9 échantillons parvenus au laboratoire pour analyse (L),
– 2 échantillons achetés dans le commerce (C).

METHODES ET TECHNIQUES

ANALYSES POLLINIQUES

L’analyse pollinique ou la melissopalynologie est l’étude des grains de pollen contenus dans les miels. Le but est d’établir la typologie des miels à partir de leur contenu pollinique. Elle comprend l’analyse pollinique qualitative et l’analyse pollinique quantitative.

Analyse pollinique qualitative

L’analyse pollinique qualitative a pour but d’identifier et de dénombrer les types polliniques présents dans une préparation de miel, ce qui permet d’établir un spectre pollinique en calculant les fréquences relatives pour chaque échantillon (LOUVEAUX & al., 1970, 1978 ; VON DER OHE & al., 2004).

Traitements physico-chimiques des échantillons

Avant l’observation au microscope, les miels ont subi des traitements physico-chimiques. Les étapes de ces traitements ont été les suivantes :
 Homogénéisation et pesage de l’échantillon
L’homogénéisation permet la dispersion uniforme des pollens dans le miel. L’échantillon a été remué avec un agitateur. La quantité standard de miel utilisée pour les analyses polliniques est de 10 à 15g (VERGERON, 1964).
 Elimination des sucres et extraction du pollen
Les sucres noircissent la préparation lors de l’acétolyse donc il est nécessaire de les éliminer et cette étape permet d’extraire les pollens. L’extraction a consisté à diluer chaque échantillon de miel dans 20 ml d’eau distillée. Le mélange a été porté au bain-marie à 40°C en agitant jusqu’à une dissolution complète. La solution obtenue a été centrifugée à 2000 tours/minute pendant 10 minutes. Le surnagent contenant les sucres et d’autres substances a été éliminé et le culot a été repris dans de l’eau distillée pour un deuxième lavage et même un troisième si nécessaire. Avant l’acétolyse, de l’acide acétique glacial a été ajouté au culot pour le déshydrater. Après agitation, l’acide a été éliminé par centrifugation.
 Acétolyse
L’acétolyse utilisé est celui d’ERDTMAN (1943 ; 1952), qui a pour but la destruction du contenu cytoplasmique des pollens. Cette méthode permet une meilleure identification des pollens grâce à la clarification des structures de la paroi pollinique (GADBIN, 1979 ; LOBREAU-CALLEN & CALLEN, 1982).
Lors de cette fossilisation artificielle, les pollens sont traités chimiquement de façon à les vider de leur contenu cytoplasmique et toute substance non exinique est détruite (ERDTMAN, 1943 ; 1952). Les pollens ont été traités dans un mélange acétolysant composé de 9ml d’anhydride acétique et de 1ml d’acide sulfurique, préparé juste avant l’utilisation. L’ensemble a été porté au bain marie à 100°C pendant 3 minutes et a été agité périodiquement. La réaction a été arrêtée par addition d’acide acétique glacial, qui a été ensuite éliminé par centrifugation. Le culot obtenu a été lavé à l’eau distillée et a été séché pendant 24 heures avant d’être monté entre lame et lamelle.

Montage des préparations

Le montage du culot a été effectué dans de la gélatine glycérinée (Annexe 3). Ce montage, appelé montage fixe, présente l’avantage d’une meilleure conservation de la préparation et les pollens y sont immobilisés.

Conduite de l’analyse qualitative

 Identification des pollens
Avant le dénombrement, une reconnaissance préliminaire des types polliniques présents dans la préparation est requise. Les grains de pollen de chaque préparation ont été inventoriés au microscope photonique Zeiss au grossissement x1000 à immersion d’huile en balayant chaque préparation.
L’identification des pollens rencontrés dans une préparation pollinique porte sur les caractères suivants :
– la forme et la symétrie,
– les dimensions du grain de pollen,
– le nombre et la forme des apertures,
– l’ornementation de l’exine.
La terminologie adoptée est celle de VAN CAMPO (1957) et de PUNT & al. (1994) décrite en annexe 4.
Les pollens des préparations de miels ont été identifiés par comparaison avec des préparations de référence existant au laboratoire de Palynologie de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo.
Des résultats publiés dans des ouvrages et des périodiques spécialisés ont servi de références lors de la détermination, en particulier les articles de STRAKA dans « Pollens et Spores » (1966 à 1980) et dans « Tropische und subtropische Pflanzenwelt » (1983 à 1989), ainsi que l’ouvrage « Pollens des savanes d’Afrique orientale » (BONNEFILLE & RIOLLET, 1980). Différents travaux de recherches effectués à Madagascar en aérobiologie (RAJERIARISON, 1984 ; RAMAVOVOLOLONA, 1986) et en melissopalynologie (RAMAMONJISOA, 1992 ; RALIMANANA, 1994 ; RAHARIMBOLA, 2001 ; RAZAFINDRAKOTO, 2005 ; RANDRIANARIVELO, 2010) renferment également des études morphologiques des pollens malgaches accompagnées de photographies qui ont servi pour la reconnaissance des pollens.
Les références utilisées ont permis de déterminer les pollens, pour la plupart au niveau du genre et quelquefois au niveau de l’espèce. Dans certains cas, cette détermination a dû être arrêtée au niveau de la famille à cause des caractères homogènes des pollens de cette famille. Le terme cf. (confer) est utilisé lorsqu’un pollen a des caractères morphologiques similaires avec ceux d’un pollen déjà identifié. Cependant, des pollens ont dû être classés « Indéterminés ».
 Comptage
Après l’inventaire des pollens présents dans la préparation, le comptage a été effectué au grossissement x630 du microscope photonique. Selon VERGERON (1964), il est indispensable de compter au moins 1200 pollens pour avoir une représentation valable des taxons ou types polliniques existants dans une préparation de miel. A cause de l’hétérogénéité de la répartition des grains de pollen, le comptage a été effectué champ par champ dans les différentes zones de la préparation.
Le comptage est arrêté lorsque tous les taxons inventoriés ont été rencontrés au moins une fois.

Présentation des résultats

 Courbe d’apparition des types polliniques
Une courbe d’apparition des taxons peut être tracée pour servir de test préliminaire afin de vérifier si après un comptage de 1200 pollens tous les types polliniques présents dans une préparation sont rencontrés au moins une fois. Cette courbe permet donc de connaître la richesse pollinique d’un miel et de vérifier la représentativité des analyses effectuées. Au début du comptage, la courbe est fortement ascendante, puis la pente diminue et enfin il se forme un palier (VERGERON, 1964).
 Etablissement du spectre pollinique
Le résultat de l’analyse pollinique qualitative est représenté par un spectre pollinique qui traduit les proportions des divers types de pollens identifiés. Lorsque les numérations ont été faites sur 1200 grains de pollen au moins, l’expression des fréquences en pourcentages est acceptable dans la formulation des résultats (LOUVEAUX & al., 1970 ; 1978).
Le spectre pollinique d’un miel a été établi en calculant la fréquence relative des types polliniques d’une préparation. Cette fréquence relative, exprimée en pourcentage, a été obtenue en effectuant le rapport du nombre de grains de pollen d’un type pollinique sur la totalité de grains de pollen comptés dans une préparation, selon la formule suivante :
FR (%) = x 100
FR : fréquence relative en %
n : nombre de grains de pollen comptés pour le taxon
N : nombre total de grains de pollen comptés dans la préparation
Le spectre pollinique d’un échantillon peut être présenté sous forme d’une feuille de comptage permettant ainsi de voir le nombre de pollens comptés pour chaque taxon.

Analyses et interprétations des résultats

 Classification des pollens par catégorie de fréquence relative
Selon leur fréquence relative, les pollens rencontrés dans les préparations peuvent être classés suivant les 4 classes préconisées par LOUVEAUX & al. (1970 ; 1978) :
– pollen dominant (fréquence > 45%)
– pollen d’accompagnement (16 ≤ fréquence ≤ 45%)
– pollen isolé important (3 ≤ fréquence ≤ 15%)
– pollen isolé (fréquence < 3%)
 Détermination de l’origine florale des miels
En général, l’apparition d’un pollen au stade dominant dans un miel permet d’admettre que ce miel provient principalement d’une certaine source de nectar (LOUVEAUX & al., 1970 ; 1978). La présence d’un pollen dominant peut donc indiquer un miel monofloral et permet de donner au miel le nom de la plante correspondante. Par contre, l’absence de pollen dominant permet d’indiquer un miel polyfloral, également appelé miel toutes fleurs. Toutefois, des exceptions peuvent être dues à une surreprésentation ou à une sous-représentation de certains pollens par rapport à la proportion de nectar (LOUVEAUX & al., 1970 ; 1978 ; VON DER OHE & al., 2004). La détermination de l’origine florale permet d’établir la typologie des miels rencontrés.
 Détermination des pollens caractéristiques de l’origine géographique
L’origine géographique est le lieu de production du miel. Elle peut être reconnue, dans certains cas relativement rares, grâce à des pollens caractéristiques, mais le plus souvent c’est l’apparition d’associations de pollens qui permet de localiser cette origine (LOUVEAUX & al., 1970 ; 1978).
Pour cette étude, la connaissance de l’origine géographique est déduite à partir de deux méthodes:
 La fréquence d’apparition des types polliniques dans les miels
La fréquence d’apparition d’un taxon a été déterminée par la présence ou l’absence de ce taxon dans la totalité des échantillons étudiés. Cette fréquence est obtenue en calculant le rapport entre le nombre des échantillons contenant le taxon et le nombre total des échantillons étudiés suivant la formule suivante : ∑ Avec FA : fréquence d’apparition d’un taxon en %
ni : nombre des échantillons contenant le taxon
∑ ni : nombre total des échantillons étudiés
La classification utilisée par LOUVEAUX & al. en 1978 a été adoptée, elle comprend quatre catégories :
– Classe 1 : taxon très fréquent, présent dans plus de 50% des échantillons,
– Classe 2 : taxon fréquent, présent dans 20 à 50% des échantillons,
– Classe 3 : taxon peu fréquent, présent dans 10 à 20% des échantillons,
– Classe 4 : taxon rare, présent dans moins de 10% des échantillons.
Les taxons très fréquents (FA > 50%) sont considérés comme caractéristiques de l’origine géographique des miels d’une provenance géographique déterminée.
 Le traitement statistique des spectres polliniques
Pour le traitement statistique, une analyse factorielle des correspondances (AFC) a été effectuée. L’AFC permet de réaliser un ou plusieurs graphes à partir d’un tableau de données, en réduisant les dimensions de l’espace de représentation des données tout en essayant de ne pas perdre trop d’information au moment de cette réduction (AMBAPOUR, 2003). Son objectif est d’analyser la liaison entre deux variables, représentées sur un tableau où les modalités de l’une sont montrées sur les lignes et celles de l’autre sur les colonnes. Plus précisément, l’AFC consiste à réaliser une analyse sur les profils-lignes et une autre sur les profils-colonnes. Les résultats de ces deux analyses sont superposés pour produire un graphique (ou plusieurs) de type nuage de points, dans lequel sont réunies les modalités des deux variables considérées, ce qui permet d’étudier les correspondances entre ces modalités, c’est-à-dire la liaison entre les deux variables (BACCINI, 2010).
Pour cette étude, l’analyse factorielle des correspondances permet de regrouper les échantillons de miels et les types polliniques. Elle a été effectuée à partir du logiciel XLSTAT 7.0.
Le tableau des spectres a été transformé en un tableau codé, donc on dispose de plusieurs échantillons sur lesquels les types polliniques sont mesurés. Ainsi, on code par 1 si un type pollinique est présent dans un échantillon et par 0 s’il ne l’est pas. En AFC, le tableau à analyser est symétrique par rapport aux indices échantillons et types polliniques. Deux lignes sont considérées comme proches si elles s’associent de la même façon à l’ensemble des colonnes. Symétriquement, deux colonnes sont proches si elles s’associent de la même façon
à l’ensemble des lignes. L’analyse factorielle des correspondances permet donc d’analyser les proximités entre les types polliniques et les échantillons.

Analyse pollinique quantitative

L’analyse pollinique quantitative a pour but d’évaluer la teneur absolue en grains de pollen dans une unité de poids de miel, c’est-à-dire dans 10g (LOUVEAUX & al., 1978 ). Cette richesse en pollens d’un miel est également utilisée pour caractériser son origine botanique mais permet aussi, dans certains cas, de déduire le mode d’extraction ou l’état de propreté du miel.

Préparation du miel

Avant de peser 10g, le miel a été homogénéisé à l’aide d’un agitateur. Ensuite, il a été mélangé avec de l’eau distillée et centrifugé à 2000 tours/minute. Le culot a été soumis à plusieurs lavage dans de l’eau distillée afin d’extraire les pollens.

Montage des préparations

Un montage mobile a été utilisé pour l’analyse quantitative. Le montage du culot de centrifugation a été effectué dans de la glycérine phénolée, dont le détail est en annexe 3. Ce montage permet la rotation des pollens, et ainsi leur étude est facilitée grâce à plusieurs axes d’observation.
Pour une bonne dispersion des grains de pollen, le culot a été dilué dans dix fois son volume avec de la glycérine phénolée et 50 µl ont été montés entre lame et lamelle. Ainsi, le volume du culot a été mesuré (Annexe 5).

Conduite de l’analyse quantitative

Pour cette étude, l’évaluation de la teneur absolue en pollens des miels a été effectuée à partir du comptage des grains de pollen dans un certain nombre de lignes qui ont été systématiquement balayées. Les pollens ont été comptés systématiquement d’un bord à l’autre de la préparation. Le comptage a été effectué suivant 5 lignes de la préparation montrées sur la figure 3.

Table des matières

INTRODUCTION
Chapitre I: GENERALITES
I. LE LITCHI ET LES MIELS DE LITCHI
I.1. Le litchi
I.1.1. Classification
I.1.2. Description
I.1.3. Répartition à Madagascar
I.2. Les miels de litchi
I.2.1. Production
I.2.2. Caractéristiques
II. NORMES SUR LE MIEL
III. CARACTERISTIQUES DE LA ZONE D’ETUDE
Chapitre II : MATERIELS ET METHODES
I. MATERIEL D’ETUDE
II. METHODES ET TECHNIQUES
II.1. ANALYSES POLLINIQUES
II.1.1. Analyse pollinique qualitative
II.1.2. Analyse pollinique quantitative
II.2. ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES
II.2.1. Mesure de l’humidité ou de la teneur en eau des miels
II.2.2. Détermination des autres paramètres de qualité des miels
Chapitre III : RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I. RESULTATS DES ANALYSES POLLINIQUES
I.1. RESULTATS DE L’ANALYSE POLLINIQUE QUALITATIVE
I.1.1. Résultats des tests préliminaires
I.1.2. Les spectres polliniques des miels étudiés
I.1.3. Les catégories de pollens
I.1.4. Regroupement des taxons selon leur fréquence d’apparition
I.1.5. L’analyse factorielle des correspondances pour les miels de litchi
I.2. RESULTATS DE L’ANALYSE POLLINIQUE QUANTITATIVE
I.3. TYPOLOGIE DES MIELS
I.4. DESCRIPTION POLLINIQUE
II. RESULTATS DES ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES
II.1. Teneur en eau ou humidité des miels
II.2. Résultats des autres paramètres de qualité
Chapitre IV : DISCUSSIONS
I. ORIGINE FLORALE DES MIELS
I.1. Influence des plantes butinées sur les spectres polliniques
I.2. Miels à dominance pollinique
I.2.1. Miels à dominance du pollen de Litchi chinensis
I.2.2. Miels à dominance du pollen de Macaranga cuspidata
I.2.3. Miel à dominance du pollen de Mimosa pudica
I.3. Miels sans dominance de pollen
II. ORIGINE GEOGRAPHIQUE
III. QUALITE DES MIELS
IV. VALEURS REFERENTIELLES RECOMMANDEES
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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