LA PRISE EN CHARGE DES PORTEURS CHRONIQUES DE L’HEPATITE B

Quantification de la charge virale du VHB

Le test VHB COBAS AmpliPrep / TaqMan 48 est un test d’amplification de l’acide nucléique pour quantifier le nombre de virus de l’hépatite B contenu dans le plasma humain. Il est basé sur deux processus majeurs : la préparation des échantillons pour isoler l’ADN des particules virales et l’amplification de l’ADN par la PCR en temps réel. Cette reaction de PCR est simultanée à la détection du clivage de la sonde fluorescente (à double marquage) spécifique à la cible. Le Master Mix assure une quantification équivalente des différents génotypes (A à H) du VHB. Il contient des paires d’amorces et des sondes spécifiques à l’ADN du VHB et au standard de quantification (SQ) : c’est un fragment d’ADN non infectieux qui contient les séquences du VHB, des sites de fixation des amorces identiques à ceux de l’ADN du VHB et une seule zone spécifique à la fixation de la sonde, ce qui permet de distinguer l’amplicon du SQ de l’amplicon du VHB. La détection de l’ADN amplifié est réalisée en utilisant une cible spécifique et une sonde fluorescente à double marquage spécifique à l’ADN du SQ : Il compense les effets d’inhibition puis contrôle les processus de préparation et d’amplification de l’acide nucléique permettant une quantification plus précise de l’ADN du VHB dans chaque échantillon. La SQ du VHB est ajouté à chaque échantillon avec un nombre de copie connu et est acheminé dans les différentes étapes de ce test de l’extraction à l’amplification. L’analyseur COBAS TaqMan 48 calcule la concentration d’ADN du VHB dans les échantillons en comparant le signal VHB à celui du Standard de Quantification pour chaque échantillon et contrôle

 Intérêt de la charge virale

La charge virale, aussi appelée titre viral, est le nombre de copies d’un virus contenu dans un volume de fluide biologique donné (sang, sperme, salive….). Elle peut être exprimée en Unité Internationale (UI) ou en copies / millilitre, ou à l’échelle logarithmique. Cette mesure de la charge virale est importante au diagnostic, à la prise de décision relative au traitement et au suivi d’un patient souffrant d’hépatite B chronique. Elle définit aussi la réponse virologique au traitement, et permet de guider l’indication du traitement qui repose également sur le taux des transaminases et le degré d’atteinte histologique du foie. Dans cette optique, il est recommandé de quantifier la charge virale par une méthode de PCR en temps réel sensible qui permet une quantification de l’ADN viral sur une large plage avec un seuil de détection de 20 UI.

L’extraction de l’ADN viral

L’appareil COBAS AmpliPrep permet l’automatisation de la préparation des échantillons pour le dosage quantitatif des acides nucléiques. Il automatise l’extraction et la purification de l’ADN du virus grâce à la technologie des billes magnétiques. La procédure traite 500 microlitre (μL) de plasma [29]. Principe : Les particules virales du VHB sont lysées par incubation à température élevée (60°C) avec une protéase et une solution tampon de lyse chaotropique qui libère des acides nucléiques et protège l’ADN du VHB contre les DNases : la protéase, un nombre connu de molécules d’ADN du SQ et les particules magnétiques sont introduits dans chaque échantillon avec le réactif de lyse. Par la suite, le mélange est incubé à 37°C. L’ADN du VHB et celui du SQ sont capturés par des particules magnétiques grâce aux ligands (polymères, les verres poreux, les silices ou particules magnétiques inorganiques) présents à la surface de ces particules magnétiques. Les autres substances telles que les sels, les protéines et autres impuretés cellulaires, sont éliminées lors du lavage des particules magnétiques de verre à l’aide d’un aimant Après fixation des billes et achèvement des étapes de lavage, les acides nucléiques adsorbés sont élués avec une solution aqueuse. L’échantillon traité (contenant les particules magnétiques de verre ainsi que l’ADN viral et celui du SQ) est associé au master mix dans des tubes k puis transféré à l’analyseur COBAS TaqMan 48 [32,33]. Figure 31 : Extraction de l’ADN viral par les billes magnétiques 3. Procédure de l’extraction La phase d’extraction de l’ADN du VHB comporte plusieurs étapes : l’entretien et l’amorçage du COBAS AmpliPrep, la création des ordres associé à la préparation du rack d’échantillons, le chargement du rack d’échantillons, des réactifs, des jetables (SPU, tubes K et embouts K), du K carrier et en fin l’extraction automatisée proprement dite.

Entretien et amorçage du COBAS AmpliPrep

L’interrupteur On Off commande l’alimentation de l’appareil. Lorsqu’il est mis en position On, le COBAS AmpliPrep démarre puis le système procède à l’initialisation en réalisant une série de contrôles diagnostiques et un amorçage. A la fin de l’initialisation, aucun DEL pour rack de la barre indicatrice ne clignote et la DEL d’état (située sur le côté droit de la barre indicatrice) devient verte. L’icône de température, située sous l’onglet System de la fenêtre Systems du logiciel AmpliLink, reste rouge jusqu’à ce que les divers incubateurs atteignent la température adéquate. Dans ce cas, il est recommandé de laisser les incubateurs atteindre la température adéquate pendant 35 minutes en passant du mode spécifique au mode générique. Ces procédures de maintenance sont effectuées lors du démarrage du système et se déroulent comme suit : – Activer la Data Station pour le logiciel AMPLILINK en se connectant d’abord au système d’exploitation Windows, ensuite double-cliquez sur l’icône du logiciel AMPLILINK et en fin se connecter au logiciel AMPLILINK en entrant l’identifiant et le mot de passe assignés. – Vérifier l’état du réactif de lavage à l’aide de l’écran d’état et remplacez-le si nécessaire. – Accéder aux onglets Service Due de l’appareil COBAS AmpliPrep dans la fenêtre Systems du logiciel AMPLILINK afin d’afficher les instructions relatives à l’entretien puis enregistrer les procédures d’entretien lors de leur réalisation. – Effectuer les tâches de maintenance répertoriées sous l’onglet Due. A la fin des procédures de maintenances, l’instrument COBAS AmpliPrep redémarre automatiquement et le système est ainsi prêt à fonctionner. b) Création des ordres Une liste de travail est, soit imprimée ou soit établie manuellement, selon l’ordre des demandes de charge virale enregistrées sur la base de données Inlog. Cette même liste est reproduite dans l’interface de travail de l’ordinateur central comme suit : – A l’aide du logiciel AMPLILINK sous l’onglet Sample de la fenêtre Orders, des ordres de spécimen pour chaque échantillon et contrôle sont créés par saisie en sélectionnant le type de test approprié (test VHB) puis sauvegardées. – A la fenêtre Orders sous l’onglet Sample Rack du logiciel AMPLILINK, une position du rack d’échantillon est attribuée à chaque ordre de spécimen et contrôle. Cependant, le numéro du rack d’échantillons sélectionné doit correspondre à celui du rack préparé. Par la suite, tous les échantillons qui ont une demande de charge virale sont rassemblés et rangés en doublon sur un portoir selon le même ordre préétabli sur la liste de travail. Figure 32 : Sang total prélevé et centrifugé sur E.D.T.A en doublon. c) Préparation du rack d’échantillons Le rack d’échantillons étiqueté est muni de code-barres comportant le numéro d’identification du rack. Chacune de ces 24 positions du rack d’échantillons peut accueillir un tube S et un clip de code-barres qui sont nécessaires pour chaque échantillon et contrôle. Un tube K individuel est placé à coté de chaque tube S d’entrée sur le rack d’échantillons. Figure 33 : Tube S, tube K et clips de code-barres d’échantillon et de contrôle. Grâce à ces clips de code-barres, le logiciel AMPLILINK conserve les informations relatives à l’état des échantillons et contrôles. Ces clips de codes-barres pour les contrôles doivent avoir un numéro de lot identique à celui des flacons de contrôle du kit de réactif. Au cas contraire, il sera impossible d’ordonner plusieurs tests sur un même rack d’échantillons car chaque test doit correspondre à un rack d’échantillons unique.