Le contrôle et les traitements de la malaria

Les vaccins

Avec l’apparition de souches multirésistantes, il devient urgent de développer une stratégie vaccinale efficace. Cette stratégie peut être divisée en deux objectifs : induire une immunité contre la malaria clinique (cible les antigènes du stade exo-érythrocytaire et érythrocytaire) et induire une immunité afin de restreindre la transmission (cible les antigènes du stade exo-érythrocytaire, sexué et sporogénique) 86. À ce jour, un seul candidat a réussi les essais cliniques de phase III et à être approuvé commercialement. Il s’agit du vaccin RTS,S.

Le Vaccin RTS,S

En 2015, le vaccin RTS,S/AS01E (adjuvant AS01), commercialisé sous le nom de Mosquirix par le groupe GlaxoSmithKline, a officiellement été homologué par les agences réglementaires européennes. Il s’agit d’un vaccin à base de protéines recombinantes ciblant la CSP, exprimée à la surface des sporozoïtes. La protéine recombinante correspond à une partie de la CSP fusionnée à la protéine S de l’enveloppe du virus de l’hépatite B (AgsHB) (RTS). Cette protéine fusion est ensuite co-exprimée avec cette même AgsHB (S) (Figure 7)87,88. Finalement, lorsque co-exprimées ensemble dans la levure, les protéines RTS et S s’assemblent spontanément pour former des pseudoparticules virales mixtes qui constituent la base de la stratégie vaccinale87.
L’étude clinique de phase III fût conduite sur une cohorte de bébés (6-14 semaines) et de jeunes enfants (5-17 mois) sur 11 sites africains. L’étude a démontré que le vaccin permettait de réduire de 39% les cas de malaria cliniques et de 31.5% les cas sévères chez les enfants de 5 à 17 mois ayant reçu quatre doses de vaccin. Cependant, aucun effet bénéfique notable n’a été observé chez la cohorte vaccinée entre l’âge de 6 à 14 semaines89. Ces résultats montrent que malgré le fait que le vaccin soit modérément efficace, il permet de réduire la mortalité et la morbidité de façon appréciable chez la population la plus à risque. Il représente donc, jusqu’au développement d’un vaccin grandement plus efficace, une stratégie importante dans la lutte contre la malaria90.
Figure 7 : Représentation schématique du vaccin RTS,S

La biologie du stade asexué de P. falciparum

Le stade asexué de P. falciparum est central dans la pathologie associée à la malaria. Il s’agit du principal stade étudié in vitro et représente une cible importante pour le développement de nouveaux traitements antimalariaux et de stratégies vaccinales. De ce fait, l’ensemble des projets présentés dans cette thèse ainsi que les caractéristiques biologiques et cellulaires décrient par la suite concerneront principalement le parasite lors du cycle érythrocytaire.

Le complexe apical

Le complexe apical est caractéristique et unique à la famille Apicomplexa. Il est composé de trois organites sécrétoires : les rhoptries, les micronèmes et les granules denses (Figure 8). Lors du stade érythrocytaire, ces organites et la majorité des protéines qu’ils contiennent sont essentiels à la survie du parasite et à l’invasion productive du globule rouge. De par ce rôle, les protéines apicales sont synthétisées de novo et tardivement lors du cycle érythrocytaire (environ dix heures avant la rupture du globule rouge infecté).

Les rhoptries

Chez le mérozoïte, les rhoptries sont des organites en forme de poire et toujours présents en paire à l’extrémité apicale du parasite. Il s’agit d’un organite entouré d’une simple membrane qui peut être divisé en deux sous-régions : le bulbe (région basale) et le cou (région apicale) (Figure 8)91. Les protéines de rhoptries sont délibérément et spécifiquement localisées dans l’une ou l’autre de ces régions, et ce selon leur ordre de sécrétion lors de l’invasion.
Figure 8 : Les organites du complexe apical et ses protéines
Les protéines RAP
Le complexe de protéines RAP (« Rhoptry associated protein ») ou « low molecular weight » (LMW) est localisé au bulbe des rhoptries et est composé des protéines RAP1, RAP2 et RAP3. Ce complexe est présent sous forme d’hétérodimère avec la protéine RAP1 : RAP1/RAP2 ou RAP1/RAP3. Le rôle de ces protéines n’est cependant pas bien déterminé. Par contre, il a été révélé que le complexe RAP1/RAP2 participe à l’invasion, d’une façon mal définie, puisque l’utilisation d’anticorps anti-RAP1 et anti-RAP2 inhibe l’invasion du globule rouge in vivo92,93. Cependant, de façon contradictoire, l’ablation du complexe RAP1/RAP2 ne semble pas affecter la capacité et le phénotype d’invasion du parasite, in vitro. De plus, il a été montré que RAP1 joue un rôle crucial dans le transport de la protéine RAP2 vers les rhoptries94.
Les protéines RhopH
Une des composantes majeures du bulbe des rhoptries est le complexe de protéines « high molecular weight » (HMW) ou RhopH. Il est composé de trois protéines : RhopH1, RhopH2 et RhopH395,96. Pour sa part, la protéine RhopH1 est encodée par la famille de gènes clag (« cytoadherence linked asexual gene »). Cette famille de gènes est composée de cinq différents variants, permettant de produire cinq différentes protéines RhopH1 (RhopH1/clag2, clag3.1, clag3.2, clag8, clag9)97. Suite au contact entre le mérozoïte et le globule rouge, le complexe RhopH est sécrété à la surface du mérozoïte où, via la protéine RhopH3, il participe au processus d’invasion98,99. Par la suite, le complexe est transféré dans la VP puis transporté à l’intérieur de la cellule hôte à travers un translocon. Il a récemment été montré que suite à l’invasion, le complexe RhopH1/clag3-RhopH2-RhopH3 est retrouvé à la membrane plasmique du globule rouge et y forme un pore afin de favoriser l’import de nutriments pour le développement du parasite98,100,101.
Les protéines RON
Parmi les protéines retrouvées dans la région du cou des rhoptries, l’on retrouve la famille de protéines RON (« Rhoptry neck protein ») formée par RON1 à 6. Contrairement aux protéines du bulbe, ces protéines ont un rôle précoce et bien défini lors de l’invasion. Il a en effet été montré qu’elles sont impliquées dans la formation de la jonction serrée en formant un complexe avec la protéine de micronèmes AMA1 (« apical membrane antigen 1 »). Suite à leur sécrétion, les protéines RONs sont transloquées dans la membrane de l’érythrocyte pour ensuite former un complexe avec la protéine micronèmale AMA1. La jonction serrée ainsi formée entre la membrane du parasite et celle du globule rouge permet de solidifier l’attachement, une étape cruciale dans le processus d’invasion102,103.
Les protéines Rh
Un autre groupe de protéines, des adhésines, localisées au cou des rhoptries est la famille RBL (« Reticulocyte binding-like »). Le génome de P. falciparum code pour cinq larges protéines RBL (>200kDa) nommées Rh1, 2a, 2b, 4 et 5. Ensemble, ces protéines jouent un rôle essentiel dans la liaison directe avec les récepteurs de surface de l’érythrocyte. Cette interaction adhésine-récepteur serait importante pour induire une cascade de signalisation afin de susciter la formation de la jonction serrée104,105.
La protéine RAMA
Finalement, RAMA (« Rhoptry-associated membrane antigen ») est une protéine atypique qui possède un groupement GPI (Glycosylphosphatidylinositol) à son extrémité C-terminale. Contrairement aux autres protéines de rhoptries, elle est exprimée de façon précoce et semble être impliquée à la fois dans l’invasion, mais aussi dans la biogenèse des rhoptries. Des études ont révélé que RAMA est exprimée avant la formation de rhoptries et est accumulée dans le système de sécrétion, à l’appareil de Golgi. De plus, au moment opportun, elle est en mesure d’y lier des protéines de rhoptries (les complexes LMW et HMW) suggérant ainsi un rôle dans le transport de protéines vers les rhoptries106. RAMA a aussi été détectée à la surface des globules rouges suite au relâchement des protéines de rhoptries proposant aussi un rôle d’attachement lors de l’invasion107.

Les micronèmes

Les seconds organites apicaux sécrétoires sont les micronèmes. Ces dernières, beaucoup plus petites et allongées que les rhoptries, sont réparties de part et d’autre de celles-ci (Figure 8). La sécrétion de protéines de micronèmes dès les premiers instants de l’invasion est principalement associée aux évènements d’attachement. Parmi les protéines les plus étudiées, on retrouve les protéines AMA1 et EBA175. Tout d’abord, AMA1 est une protéine essentielle impliquée dans l’attachement du parasite à sa cellule hôte. Suite au contact initial avec l’érythrocyte, AMA1 interagit avec la protéine RON2 afin de former la jonction serrée108. Il a aussi été proposé que sa présence à la jonction serrée entraînerait le relargage de protéines de rhoptries109.
Ensuite, on retrouve la protéine EBA175 qui interagit avec la protéine Glycophorine A à la surface du globule. Elle fait partie de la grande famille des EBL (« Erythrocyte binding-like ») dont fait aussi partie la protéine PfEMP1. Cette famille est caractérisée par la présence de domaines « Duffy binding-like » (DBL) riches en cystéines et habituellement impliqués dans les interactions avec les cellules hôtes110,111.

Les granules denses

Finalement, les granules denses (GD) sont les derniers organites à sécréter leur contenu lors de l’invasion. De forme plutôt ronde, ces organites contienent des protéines qui vont exercer des fonctions lors des dernières étapes de l’invasion : la formation et le développement de la VP. De ce fait, la majorité des protéines de GD vont être sécrétées à l’intérieur de la VP nouvellement formée112. La première protéine de GD identifiée et la plus caractérisée est la protéine RESA (« Ring-infected Erythrocyte Surface Antigen »)113. Elle est sécrétée dans la VP une fois l’invasion terminée puis est transportée via le translocon PTEX (« Plasmodium translocon of exported protein ») jusqu’au cytoplasme de l’érythrocyte114. Elle interagit alors avec la protéine spectrine de l’hôte de façon à stabiliser la membrane de l’érythrocyte afin d’éviter sa dégradation115,116.

L’invasion du globule rouge

L’invasion du globule rouge par le mérozoïte est une étape critique qui est accomplie par les effecteurs contenus dans les organites du complexe apical. La sous-compartimentalisation et la sécrétion ordonnée sont primordiales afin de coordonner précisément les différentes étapes menant à l’établissement du cycle érythrocytaire. Ce processus d’invasion peut être décortiqué en 4 étapes : l’attachement, la réorientation, l’invasion et la post-invasion (Figure 9)117,118.
Figure 9 : L’invasion du globule rouge (Adaptée de 119)

1o L’étape d’attachement
Suite à la rupture du schizont, les mérozoïtes libérés dans le sang sont exposés à un environnement faible en ions potassium. Ce stimulus extérieur entraîne une augmentation de la concentration cytosolique en calcium. Cette hausse du niveau de calcium interne déclenche la translocation de protéines de micronèmes à la surface du mérozoïte. Parmi ces nouvelles protéines de surface, on retrouve les protéines EBA175 et AMA1. Leur sécrétion permet de restaurer le niveau basal en calcium en plus de provoquer le relâchement des protéines de rhoptries Rh à la surface120.
Parallèlement, les mérozoïtes nouvellement expulsés sont non motiles et vont passivement diffuser dans le milieu jusqu’à ce qu’ils rencontrent un globule non infecté. Le premier contact entre le parasite et la cellule cible s’effectue via les protéines de surface du mérozoïte MSP (« merozoite surface protein ») et plus particulièrement la protéine MSP1. Il s’agit de la protéine la plus abondante à la surface du mérozoïte, où elle est attachée par une ancre GPI121. Ce premier contact est de faible affinité et permet au groupe de ligands EBL/Rh d’entrer en jeux. Ces groupes de ligands sont fonctionnellement redondants et définissent un ensemble de voies d’invasion alternatives selon les récepteurs présent à la surface de l’érythrocyte. Parmi ces paires ligands-récepteurs on retrouve EBA175/Glycophorine A pour la voie dépendante de l’acide sialique ou encore Rh4/Récepteur de complément 1, une voie indépendante de l’acide sialique111,122. Ces étapes de reconnaissance et d’adhésion permettent de s’assurer d’être attaché à la bonne cible et de sécuriser l’attachement.

2o L’étape de réorientation
Par la suite, le parasite doit se réorienter afin de mettre en contact son pôle apical avec la membrane de l’érythrocyte. Cette manœuvre se fait de façon passive sans l’aide du moteur d’actine-myosine. Une explication avancée pour expliquer ce mouvement est que la liaison des molécules Rh et EBL à l’étape précédente occasionne des déformations et des mouvements dans la membrane du globule rouge entraînant le parasite à bouger. De plus, comme la concentration en ligands est plus forte au pôle apical, le parasite est forcé de suivre ce gradient et se retrouve côté apical aligné avec la surface de l’érythrocyte123. Une fois le contact établi, on assiste à la formation de la jonction serrée, une étape cruciale qui permet au parasite de se lier de façon irréversible. La jonction serrée est principalement constituée des protéines AMA1 et RONs. Au moment de sa formation, les protéines RONs (RON2, 4 et 5) sont sécrétées puis transloquées et insérées dans la membrane de l’érythrocyte. La protéine AMA1 présente à la surface du parasite peut ensuite lier la surface de l’hôte via une interaction avec la protéine RON2 (Figure 9). Cette jonction serrée de forte affinité est stable et mobile au cours de l’invasion102.

3o L’étape d’invasion
Lors de l’invasion, la jonction serrée va se déplacer du pôle apical au pôle basal au fur et à mesure de la progression du parasite à l’intérieur de l’érythrocyte. Le parasite se retrouve donc à passer au travers cette jonction serrée, et ce tout en formant la VP. Ce déplacement est causé par le moteur d’actine-myosine du parasite combiné à l’IMC (voir section 1.3.3.1). Situé directement sous la MPP, l’IMC est un complexe multiprotéique interagissant à la fois avec les molécules de la jonction serrée et celle du moteur d’actine-myosine. De cette façon, les molécules de myosine, attachées à l’IMC, vont marcher sur les filaments d’actine, liés aux adhésines de surface, propulsant le parasite vers l’avant. Au fur et à mesure de la progression, les adhésines sont clivées par des protéases afin de permettre au parasite d’avancer vers le prochain point d’adhésion34,124. C’est au moment de l’entrée du parasite à travers la jonction serrée que les protéines du bulbe des rhoptries (RAP et RhopH) vont être sécrétées à l’intérieur de la VP naissante102. Simultanément, lors du passage via la jonction serrée, il y a clivage des récepteurs à la surface du mérozoïte par un clivage protéolytique accompli par la famille de protéines « sheddase ». Par exemple, la protéine de micronèmes Sub2 (« subtilisin-like protease 2») est responsable de cliver les protéines AMA1 et MSP1125.

4o L’étape post-invasion
Lors des dernières étapes de l’invasion, la jonction serrée est localisée à l’arrière du parasite, et le parasite se retrouve à l’intérieur du globule, dans la VP. C’est à ce moment que le contenu des granules denses est relargué. Finalement, la fermeture de la VP marque la fin de l’entrée du mérozoïte.
En somme, toutes ces étapes nécessaires à l’invasion se produisent dans un laps de temps très cours soit d’environ 10 minutes102.

Le complexe intra-membranaire

L’IMC est une structure essentielle et conservée chez les apicomplexés. Elle est située directement sous la MPP et prend la forme d’alvéoles ou citernes aplaties. Plusieurs de ces structures membranaires sont juxtaposées et sont supportées par un réseau de microtubules. Chez le parasite l’IMC opère trois rôles majeurs. Tout d’abord, il assure une fonction structurale et confère sa stabilité et sa rigidité à la cellule. Ensuite, comme mentionné précédemment, il joue un rôle crucial lors de l’invasion du parasite en lui fournissant la mobilité nécessaire. Finalement, il est une composante de base lors de la division cellulaire au moment de la schizogonie.

L’IMC dans l’invasion

Au moment de l’invasion, l’IMC s’associe avec le moteur d’actine-myosine et forme une structure nommée glideosome, responsable de la locomotion du parasite lors de son entrée. Le glideosome est composé de cinq protéines : la myosine A (MyoA), la chaîne légère de la myosine (MTIP ou MLC), GAP45, GAP50 et GAP40126 (Figure 10). Tout d’abord, il a récemment été montré que la protéine « glideosome-associated connector » (GAC) est responsable de lier à la fois le domaine cytoplasmique des adhésines (AMA1, Rh) ainsi que les molécules d’actine127. Ces filaments d’actine sont modulés de façon dynamique, c’est-à-dire qu’ils se polymérisent en aval du mouvement et se dépolymérisent en amont, au fil de la progression128–131. La protéine GAC assure donc la connexion entre les molécules de surface du parasite et le complexe moteur. À l’opposé, l’autre composante motrice, la MyoA, est rattachée à l’IMC via une interaction avec les autres composantes du glideosome. Cet échafaudage protéique s’ancre à la fois à la membrane de l’IMC, via la protéine transmembranaire GAP50 et à la MPP via GAP45 (Figure 10). La protéine GAP45 est donc à la fois attachée à la MPP (extrémité N-terminale) de par un motif de double acylation et à la membrane de l’IMC (extrémité C-terminale) via l’interaction avec GAP50, solidifiant ainsi le glideosome126. En résumé le moteur est fixé des deux côtés : à la MPP via l’interaction GAC-actine et à l’IMC de par l’interaction avec la myosine-glideosome.

Figure 10 : Modèle de la structure du glideosome et de la jonction serrée

L’IMC lors de la division cellulaire

Chez Plasmodium, la division cellulaire s’effectue selon le principe de schizogonie, ce qui se traduit par plusieurs rondes de division nucléaire sans division cellulaire. C’est seulement lors du dernier cycle de division nucléaire que les cellules filles vont s’assembler afin de former les nouveaux mérozoïtes. À l’opposé, chez Toxoplasma, la division cellulaire s’effectue à chaque ronde de division nucléaire, c’est-à-dire que chaque cellule mère se divise pour donner deux cellules filles (endodyogénie).

La réplication par schizogonie implique que lors de la dernière division nucléaire, le parasite doit assembler les différents organites, et ce à l’intérieur d’une nouvelle MPP. Ce rôle d’échafaud pour la ségrégation des différentes structures et membranes est assuré conjointement par les microtubules sous-pelliculaires et l’IMC (Figure 11). Tout d’abord, les microtubules vont être ancrés au pôle apical par l’anneau polaire apical, un centre d’organisation des microtubules. Ensuite, appuyé par les microtubules, l’IMC progresse graduellement vers le pôle basal en formant derrière lui de nouvelles structures d’IMC132,133. Cependant, certaines protéines de l’IMC vont plutôt se concentrer au pôle basal une fois l’IMC formé. Des protéines comme MORN1 (« membrane occupation recognition nexus 1 ») , BTP1 (« basal complex transmembrane protein 1 ») et centrine 2 vont y accomplir une fonction contractile afin de fermer l’IMC et ainsi terminer la ségrégation de la cellule fille134,135. Finalement, la MPP va s’invaginer entre les cellules filles délimitées par l’IMC et ce afin que chaque mérozoïte soit entouré par sa propre membrane.