Les détecteurs du stress oxydant caractérisation des mécanismes moléculaires de détection

La cellule perçoit les variations de la concentration en peroxydes ou en ions superoxyde grâce à des détecteurs spécifiques. Chez E. coli, la spécificité des réponses peroxyde et superoxyde repose sur l’existence de deux régulons distincts, le régulon OxyR et le régulon SoxR. La caractérisation des mécanismes moléculaires responsables de l’activation de ces deux régulateurs a permis d’établir les bases de la spécificité du processus de détection. Dans un cas comme dans l’autre, le régulateur est aussi le détecteur. Chez S. cerevisiae, les mécanismes moléculaires responsables de l’activation de la voie Yap1/Skn7, contrôlant le régulon peroxyde, sont encore mal connus et l’étude du facteur de transcription Yap1 constitue l’objet de mon travail de thèse. La forme active d’OxyR, capable de stimuler la transcription, est une forme oxydée [148]. En effet, dans un système de reconstitution in vitro, OxyR active la transcription de katG lorsqu’il est oxydé et la présence d’un agent réducteur, comme le dithiotréitol (DTT) inhibe la réaction. Cette inhibition est réversible. Pourquoi OxyR est-il inactif en conditions réductrices ? L’étude de l’interaction d’OxyR avec l’ADN a montré que seule la forme oxydée d’OxyR est capable de se lier aux promoteurs des gènes induits de façon OxyR- dépendante, suggèrant que l’oxydation de ce régulateur permet son recrutement aux promoteurs de ses gènes cibles [97] (Fig.8A). L’existence d’une liaison coopérative d’OxyR et de l’ARN Polymérase [149] indique que la forme oxydée d’OxyR serait en outre capable de recruter l’ARN Polymérase afin d’initier la transcription.

OxyR est également capable de se lier à son propre promoteur et d’en réprimer la transcription [88, 93]. Dans ce cas, la capacité d’OxyR à lier l’ADN est indépendante de son état d’oxydation [97]( Fig. 8B). En revanche, la transcription d’oxyS, un gène cible d’OxyR localisé tête-bêche avec oxyR, est spécifiquement induite en conditions oxydantes. L’activation d’oxyS ne dépend pas de la capacité d’OxyR à lier l’ADN mais d’un repositionnement d’OxyR au niveau du promoteur. La forme réduite d’OxyR se lie à deux fois deux sillons adajacents séparés par un tour d’hélice et réprime oxyR sans activer oxyS. L’oxydation d’OxyR entraîne un déplacement de son site de liaison, permettant son contact avec quatre sillons majeurs consécutifs et stimulant ainsi l’expression d’oxyS, tout en maintenant la répression d’oxyR. Ce déplacement est dû à un changement de conformation majeur d’OxyR lors de la transition entre les formes réduite et oxydée.Le centre redox d’OxyR est constitué de deux cystéines, les cystéines 199 et 208 dont l’oxydation en un pont disulfure intramoléculaire conduit au changement de conformation responsable de l’activation d’OxyR en réponse aux peroxydes [150]. La mutagénèse de la cystéine 199 (C199S) et dans une moindre mesure de la cystéine 208 (C208S) induit une hypersensibilité aux peroxydes [149]. Ces deux mutants sont transcriptionnellement inactifs in vitro comme in vivo [149, 150]. La mutagénèse des quatre autres cystéines d’OxyR n’entraîne au contraire aucune altération fonctionnelle ou phénotypique pour l’ensemble des tests effectués [149]. En particulier, un mutant ne possèdant plus que les cystéines 199 et 208 (OxyR4C-A) est sauvage.

L’étude par spectrométrie de masse de la protéine mutante OxyR4C-A, purifiée et oxydée à l’air, a démontré l’existence d’un pont disulfure entre les cystéines 199 et 208 [150]. In vivo, l’état redox d’une protéine peut être visualisé grâce à des techniques spécifiques (voir Résultats) [151, 152]. L’analyse par ces techniques des mutants des cystéines d’OxyR a permis de confirmer la formation de ce pont disulfure en réponse au H2O2 Le potentiel redox du couple OxyRred/OxyRox est de –185 mV [150]. Cette valeur, inférieure d’environ 100 mV à celle du potentiel redox intracellulaire (-280 mV), est compatible avec la présence d’OxyR sous forme réduite dans des conditions de croissance standard [151, 152]. OxyR est oxydé in vivo dès 30 secondes d’exposition au H2O2 [151]. En réponse à une dose unique de H2O2, cette oxydation est transitoire avec un retour à l’état réduit après 5 minutes d’exposition. Le profil d’oxydation d’OxyR est corrélé avec la cinétique d’activation de ses gènes cibles. Les doses requises in vivo pour l’oxydation d’OxyR sont faibles (à partir de 5 mM de H2O2 ajouté dans le milieu). Ces données montrent qu’OxyR est activé par un changement de conformation de la protéine, induit par la formation d’un pont disulfure intramoléculaire entre les cystéines 199 et 208.OxyR est désactivé par réduction. Afin de caractériser le système enzymatique responsable de sa réduction, les profils cinétiques d’activation et de désactivation d’OxyR ont été déterminés dans différents mutants de la voie des thiorédoxines et du glutathion. La désactivation d’OxyR est retardée dans des mutants grxA, gorA ou gshA, mais pas dans des mutants trxA ou trxB, suggèrant qu’OxyR pourrait être réduit par la glutarédoxine 1, via la voie du glutathion [150]. La réduction d’OxyR in vitro en présence de glutarédoxine 1, de glutathion et de glutathion réductase étaye cette hypothèse. L’expression de grxA et de gorA étant stimulée par OxyR en réponse au H2O2, le système apparaît auto-régulé [17, 94].