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Mécanismes biologiques de l’adhésion bactérienne

L’adhésion bactérienne sur un support est la première étape conduisant à la formation d’un biofilm bactérien. Elle met en jeu un certain nombre de mécanismes physicochimiques et biologiques complexes (Baillif et al., 2010). L’adhésion peut se résumer en quatre étapes dynamiques successives:

Le transport

Le transport correspond à un transfert des bactéries à proximité de la surface réceptrice sur laquelle elles peuvent adhérer. L’origine de ces bactéries est soit le recrutement des cellules du milieu soit la redistribution des cellules issues de la phase de dispersion d’un biofilm situé à proximité (Branger et al., 2012).
Le transfert des bactéries vers le support fait intervenir des phénomènes de nature physicochimique et biologique (An et Friedman, 1998; Katsikogianni et Missirlis, 2004; Branger et al., 2012):
 La diffusion passive: Elle fait intervenir des mouvements browniens dus à l’agitation thermique, ce qui anime toutes les bactéries et leur permet un déplacement aléatoire à la vitesse moyenne de 40 μm par heure.
 La sédimentation: Elle est due aux forces de gravité, qui se produit par différence de gravité entre la bactérie et le fluide dans lequel elle se trouve (Fregaed, 1991; Branger et al., 2012).
 La convection: Elle résulte de l’écoulement et les mouvements du fluide environnant.
Le transport convectif semble être particulièrement important pour l’attachement des bactéries, un régime d’écoulement turbulent favorise l’adhésion en augmentant la probabilité de la rencontre entre la bactérie et la surface (Jacobs, 2007; Branger et al., 2012).
 La motilité: Elle se définit par les mouvements propres autonomes de la bactérie, grâce à la présence sur sa surface de flagelles ou de pilis. Ce mécanisme peut être associé au chimiotactisme, qui permet aux bactéries de se rapprocher des surfaces (Jacobs, 2007; Branger et al., 2012).

L’adhésion initiale

L’ensemble des bactéries et de la surface commencent à interagir l’un avec l’autre lorsque la distance qui les sépare est de 50 nm (Branger et al., 2012); s’en suit d’une succession d’interactions de longue puis de courte distance, qui sont partiellement de nature physicochimique. Cette phase d’adhésion est tout d’abord réversible puis devient irréversible (Jacobs, 2007).

Adhésion réversible

Dans de nombreux milieux biologiques, deux types d’interactions de longue distance sont décrits. Les bactéries sont tout d’abord attirées dans un minimum énergétique secondaire par des forces d’attraction : les forces de Van der Waals. Lorsque la distance de 20 nm est franchie, il apparaît des forces de répulsion électrostatiques (Branger et al., 2012).
 Les forces de van der Waals
Ce sont des forces intermoléculaires de nature électrique, retenant ensemble des molécules et des atomes de deux corps et qui dépendent des attractions reliant les atomes et les molécules lorsqu’ils se rapprochent.
Ces forces ont une origine moléculaire résultant de l’interaction entre les électrons d’une molécule et les charges d’une autre. Les forces de van der Waals sont en général de faible intensité, elles diminuent rapidement avec la distance et il en existe trois natures résultant de trois effets physiques différents: effet d’orientation (force de Keesom), effet d’induction (forces de Debye) et effet de dispersion (forces de London) (Vergnault, 2004; Branger et al., 2012 ).
 Effet d’orientation (interaction dipôle permanent / dipôle permanent) : une attraction entre deux molécules polaires.
 Effet d’induction (interaction dipôle permanent / dipôle induit) : une attraction entre une molécule polaire et une molécule non polaire.
 Effet de dispersion (interaction dipôle induit / dipôle induit) : une attraction entre deux molécules non polaires (Boutaleb, 2007; Branger et al., 2012).
Les forces de Keesom et Debye sont négligeables en milieu aqueux, et seules les forces de London seront prises en compte par la suite. Ces forces appelées forces de Lifshitzvan der Waals sont universelles et interviennent quels que soient les corps considérés. Pour deux particules immergées dans un solvant, ces interactions vont intervenir entre la surface de la particule et le solvant, et entre les particules quand celles-ci sont suffisamment proches l’une de l’autre (Branger et al., 2012).
Ces différentes interactions sont des forces d’attraction. Pour éviter l’interpénétration des nuages électriques des deux molécules, des forces de répulsion entrent en jeu, ce sont les forces électrostatiques.
 Les forces électrostatiques de répulsion
Les interactions électrostatiques interviennent dans le cas de composés chargés. L’immersion d’une particule, une bactérie ou une surface plane dans un fluide, lui acquiert, une charge de surface provoquée par l’adsorption ionique ou l’ionisation des groupements chargés présents en surface (Boutaleb, 2007). On observe alors une accumulation de contre-ions dans la zone entourant la particule, accumulation qui se traduit par la formation d’une double couche électrique (Fregaed, 1991).
Lorsque la surface de la bactérie, globalement chargée négativement, arrive en contact avec la surface du substratum, portant une charge de meme signe, il se produit des interactions électrostatiques répulsives dues au chevauchement des deux couches superficielles chargées. (Fregaed, 1991).
L’épaisseur de la double-couche est inversement proportionnelle à la concentration en ions dans la phase aqueuse. Le pH du milieu, par son influence sur le nombre de groupements dissociés présents sur les surfaces, intervient également dans la valeur des interactions électrostatiques (Vergnault, 2004).
L’importance de ces évènements initiaux n’est pas à négliger dans le développement du biofilm malgré la multitude d’évènements ultérieurs qui auront lieu sur une échelle de temps beaucoup plus longue (Busscher et al., 1995).

Adhésion irréversible

C’est une étape plus lente que la précédente, faisant appel à des interactions irréversibles de courte distance et à des énergies plus élevées (Branger et al., 2012). Ces interactions interviennent lorsque la distance bactérie-substrat est porche du nanomètre (Fregaed, 1991).
Ces interaction irréversibles aux quelles les bactéries sont soumises sont:
 Les interactions électrostatiques
Ces interactions apparaissent entre la surface des microorganismes et la surface réceptrice, elles sont dues au recouvrement des couches associées aux groupes chargés présents à la surface de la cellule microbienne et à ceux de la surface réceptrice (Boutaleb, 2007).
Ces interactions non sélectives se caractérisent par la formation de ponts par l’intermédiaire de cations divalents (Ca2+, Mg2+) entre une charge négative de la bactérie et une charge négative du substratum. La charge négative de la surface bactérienne est fournie par l’acide lipotéichoïque pour les bactéries à Gram positif, et par le LPS des bactéries à Gram négatif.
(Bonnaure Mallet et al., 2006; Robin et al., 2011).
 Les interactions acide-base (accepteur/donneur d’électrons)
Ces interactions permettent la formation de liaisons hydrogènes (interactions de Lewis). Ce sont des interactions de nature électrique forte, de courte distance, possibles lorsqu’un atome chargé négativement est en contact avec un atome d’hydrogène lié à un atome électronégatif (Branger et al., 2012).
Un composé donné peut être hydrophile, c’est-à-dire capable d’intervenir avec des liaisons hydrogènes. Il existe différents degrés dans ce caractère, ce qui se traduit par l’existence d’interactions hydrophiles et hydrophobes plus ou moins importantes (Boutaleb, 2007).
 Les interactions hydrophobes/hydrophiles
 Attraction hydrophobe
Elles entrent en jeu lors d’une adhésion en milieu aqueux (Vergnault, 2004). L’hydrophobie est, dans cette définition, un terme utilisé pour rendre compte du comportement de molécules apolaires dans l’eau. Autour d’une particule hydrophobe, les molécules d’eau s’organisent en structure ordonnée (Vadillo-rodriguez et al., 2003), cette organisation conduit à une baisse du désordre ou d’entropie, thermodynamiquement défavorable (Dague, 2006; Boutaleb, 2007).
L’eau va donc tendre à se dissocier de ce type de surface, ce qui se traduit par une énergie d’attraction hydrophobe et par conséquent la formation des liaisons entre les molécules apolaires. Cette attraction hydrophobe dépend de la nature des particules et de leur distance de séparation, cette interaction est effective à des distances de l’ordre de 10 nm et plus (Vergnault, 2004).
 Répulsion hydrophile
La répulsion hydrophile se produit entre particules dotées d’une forte affinité pour l’eau, qui se traduit par l’existence d’une couche d’eau liée à la surface et organisée en réseau (Vergnault, 2004).
Quand les deux surfaces hydratées s’approchent l’une de l’autre, la présence de cette eau liée induit une énergie de répulsion hydrophile. Cette répulsion hydrophile est également fonction de la nature des particules et de leur distance de séparation, mais elle est effective à des distances de l’ordre de 3 à 5 nm (Boutaleb, 2007).

L’attachement

Pour se maintenir sur les surfaces dentaires durant une longue période, les bactéries doivent être vivantes et capables d’exprimer un certain nombre de gènes conduisant à l’acquisition de nouvelles structures permettant l’établissement des liaisons de haute affinité. Ces éléments se révèlent importants dans la mise en place des interactions irréversibles ainsi que dans l’étape ultérieure de multiplication bactérienne, aboutissant à la formation d’un biofilm (Baillif et al.,2010). Les interactions sont de deux ordres:
 Les interactions de type Adhésine-Récepteur
Les adhésines sont des protéines qui se fixent stéréochimiquement à des récepteurs de la PAE, essentiellement saccharidiques, en formant des ponts entre les deux surfaces (Jenkinson et Lamont, 1997). Certaines adhésines sont largement conservées chez les streptocoques oraux et sont susceptibles de jouer un rôle clé dans l’adhésion aux surfaces buccales.
La catégorie la plus connue d’adhésines bactériennes est représentée par les léctines qui sont retrouvées le plus fréquemment chez Streptococcus mutans (Fregaed, 1991).
Il existe également l’antigène I/II qui est constitué de protéines exprimées au niveau de la membrane des streptocoques commensaux oraux tels que S. gordonii, S. oralis et S. sanguinis, (Jakubovics et al., 2005). L’Ag I/II joue un rôle central dans la liaison à la glycoprotéine de la salive intégrée dans la pellicule acquise exogène, cela favorise l’adhérence avec les streptocoques.
 Les interactions de type Enzyme-Substrat
L’exemple le mieux documenté est celui de S. mutans, cette bactérie produit des complexes enzymatiques: les Glycosyltransférases (GTF) (Bowen et Koo, 2011). Ces derniers sont intégrés à la surface de la bactérie et ils sont responsables de la synthèse des polymères de type glucane en présence de saccharose (Krzyściak et al., 2014).
Ces glucanes sont fortement adhésifs, ils se fixent de manière spécifique aux récepteurs présents sur la PAE notamment les Glucan-Binding-Protein (GBP) (Lynch et al., 2013).
En ce qui concerne les récepteurs de la pellicule acquise exogène, au niveau des surfaces dentaires, autres que les GBP, on retrouve surtout des protéines riches en histidine et en Proline (PRP), le lyzozyme et l’alpha-amylase (Jenkinson et Lamont, 1997).

L’espèce Porphyromonas gingivalis

Caractéristiques de l’espèce

P. gingivalis est une bactérie à Gram négatif anaérobie stricte, appartenant à la famille des Porphyromonadaceae, ordre des Bacteroidales dans le phylum des Bacteroidetes connu anciennement sous le nom de Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides (CFB) (Nelson et al., 2003). Cette bactérie est fréquemment rencontrée dans les biofilms associés aux sites sousgingivaux, un environnement où la teneur en oxygène est faible.
Morphologiquement elle se présente sous forme de coccobacille, d’environ 2 μm de longueur et 1 μm de diamètre, isolée ou en courte chaînette. Sur gélose au sang, P. gingivalis a la particularité de former des colonies à pigmentation noire résultant de l’accumulation dans ses membranes de protoporphyrine dérivée de l’hémine contenue dans le milieu (Holt et al., 1999; Gibson et Genco, 2006).
Ce microorganisme, comme la plupart des parodontopathogènes, est dit asaccharolytique, c’est-à-dire qu’il ne métabolise pas les sucres présents dans son environnement (Mouton et Robert, 1994; Gibson et Genco, 2006; Delost, 2014). Son fort pouvoir protéolytique lui permet d’utiliser les peptides et les acides aminés de son milieu comme source d’énergie et de carbone (Mouton et Robert, 1994; Dashper et al., 20009).
Pour ce qui est de son implication dans les maladies parodontales, P. gingivalis est l’un des principaux agents étiologiques responsables de la parodontite (Holt et Ebersole, 2005; Greenwood et al., 2012; Mysak, et al., 2014). Cette bactérie représente le parodontopathogène le mieux caractérisé jusqu’à maintenant (Darveau, 2010; Cugini et al., 2013).

Facteurs bactériens de virulence

La virulence d’un agent infectieux se définit comme la capacité d’un microorganisme à causer une maladie ou à interférer avec le métabolisme ou les fonctions physiologiques de l’hôte. Les facteurs de virulence des bactéries parodontopathogènes présentent les déterminants de son pouvoir pathogène (Holt et al., 1999).
La multitude des facteurs exprimés leur permettent de coloniser efficacement l’espace gingivo-dentaire, de se multiplier et provoquer la destruction des tissus du parodonte (Amano, 2010). Ces facteurs leur donnent également la capacité d’échapper aux mécanismes de défense de l’hôte (Kinane, 2000).

Les fimbriae

La capacité d’adhésion et de formation du biofilm par P. gingivalis est assurée en grande partie par les fimbriae, structures filamenteuses recouvrant la surface de la cellule bactérienne.
Les fimbriae sont constitués par la juxtaposition d’une même protéine, la fimbrilline (Nagano et al., 2012). P. gingivalis exprime deux fimbriae distincts, les fimbriae majeurs FimA et les fimbriae mineurs Mfa1 (Lin et al., 2006).
Les fimbriae majeurs ont été proposés comme étant la première structure de la bactérie à entrer en contact avec les surfaces et les colonisateurs primaires (Enersen et al., 2013).
En effet, FimA est responsable de la coadhésion à différentes bactéries par l’entremise de différents récepteurs comme la glycéraldéhyde-3-phosphate (GAPDH) déshydrogénase chez certains streptocoques (Park et al., 2005).
Des mutants de P. gingivalis déficients en fimbriae n’adhèrent presque pas aux cellules eucaryotes (Weinberg et al., 1997). Le fimbriae de P. gingivalis permet donc l’adhérence à des récepteurs spécifiques des cellules de l’hôte, en particulier les cellules épithéliales.
Le gène de FimA n’est présent qu’en une seule copie sur le chromosome de la bactérie (Nagano et al., 2012) et la séquence protéique ne présente pas d’homologie avec d’autres protéines fimbriales (Enersen et al., 2013).
Chez P. gingivalis, 6 types de FimA ont été identifiés, et il semblerait que la virulence de P. gingivalis soit influencée par le type de fimbriae exprimé (Enersen et al., 2013).
Les fimbriae mineurs permettent eux aussi la coadhésion aux bactéries déjà présentes (Andrian et al., 2006). Ces fimbriae proviennent du gène mfa1 codant pour la sous-unité protéique Mfa. Cette dernière est nécessaire pour la reconnaissance entre P. gingivalis et Streptococcus gordonii (Lin et al., 2006).
Les fimbriae sont immunogeniques modulant la production de cytokines pro-inflammatoires comme IL-l, IL-6, et le facteur tumoral de nécrose (TNF-α) et induisent l’activation des lymphocytes T (Gipson et Genco, 2006). Il a été démontré que la production de cytokines par les cellules dendritiques est grandement diminuée lorsque P. gingivalis n’exprime pas de fimbriae majeur (Jotwani et Cutler, 2004).

Les hémagglutinines

L’activité hémagglutinante de P. gingivalis est liée d’une part aux fimbriae, et d’autre part à des hémagglutinines distinctes des fimbriae à tout stade de la synthèse ou de l’assemblage mais les deux structures forment un complexe (Du et al., 1997).
Ces protéines membranaires contribuent à l’établissement de la bactérie dans les sites sousgingivaux (Du et al., 1997 ; Ema et al., 2003). Elles fonctionnent souvent comme des adhésines par lesquelles les bactéries se fixent aux cellules hôtes (Kozarov et al., 2000; Ema t al., 2003). Elles permettent aussi la fixation à l’hème des érythrocytes pour l’acquisition du fer (Song et al., 2005).
Cinq hémagglutinines ont été identifiées (HagA à E), dont l’hémagglutinine HagA apparait plus particulièrement impliquée. Elles sont codées par les gènes hagA, hagB, hagC, hagD, et hagE (Lépine et Progulske-Fox, 1996).
En effet, l’inactivation des gènes hagA, hagB et hagC a démontré une diminution de l’activité d’hémagglutination de la bactérie (Lamont et Jenkinson, 1998).

Le lipopolysaccharide (LPS)

Le LPS, constituant majeur de la membrane des bactéries à Gram négatif, est l’endotoxine bactérienne la plus étudiée et sans contredit, la mieux décrite actuellement dans la littérature (Kinane, 2001; Herath et al., 2011).
Le lipopolysaccharide est un constituant amphipathique qui fait partie intégrale de l’enveloppe externe des bactéries à Gram négatif. Trois parties distinctes reliées ensemble par des liaisons covalentes forment cette structure bactérienne : le polysaccharide central, l’antigène O et le lipide A. L’activité toxique et immuno-stimulatrice des LPS est attribuée au lipide A (Okada et Murakami, 1998; Doucet et Lowenstein, 2006).
Le lipopolysaccharide de P. gingivalis est unique, tant au niveau de la structure chimique du polysaccharide et des lipides A de sa partie centrale, qu’au niveau de son activité biologique, par rapport à ceux des autres bactéries à Gram négatif (Ogawa, 1994; Ezzo et Cutler, 2003).
Le LPS est caractérisé par un faible pouvoir endotoxique : le lipide A de P. gingivalis est mille fois moins actif que celui des bactéries entériques. Il est probable que la faible action du lipide A, et surtout sa faible endotoxicité, permet à P. gingivalis de passer inaperçu dans l’hôte, et donc d’envahir le parodonte (Hirschfeld et al., 2001)
Le LPS joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies parodontales. Il est impliqué dans le déclenchement de la réponse immunitaire au cours d’une parodontite. Il stimule la sécrétion de médiateurs de l’inflammation notamment les cytokines pro-inflammatoires d’IL-1β, d’IL-6 et TNF-α (Kinane, 2001; Doucet et Lowenstein, 2006; Herath et al., 2011).

Les vésicules

Les vésicules sont des excroissances de la membrane externe de P. gingivalis. Elles sont exprimées à la surface cellulaire ou relâchées dans le milieu environnant (Mantri et al., 2015).
Les vésicules de P. gingivalis ont un diamètre compris entre 50 et 250 nm mais il est majoritairement autour de 50 nm (Xie, 2015).
Les vésicules servent de véhicule pour les toxines, les enzymes protéolytiques et les adhésines (Ho et al., 2015), elles contiennent toutes les enzymes synthétisées par la bactérie et stockées avant leur excrétion (Mayrand et Grenier, 1989).
Des études ont montré que les vésicules sont impliquées dans l’adhérence, la formation de biofilm, l’invasion et la modulation des réponses immunitaires de l’hôte (Ho et al., 2015).
Il est possible que les vésicules protègent ainsi la bactérie en fixant une partie des anticorps dirigés contre elle (Mantri et al., 2015).

Les enzymes protéolytiques

P. gingivalis possède également des facteurs contribuant à l’inactivation des mécanismes de défense de l’hôte et à la destruction tissulaire, soient les protéinases (Kadowaki et al., 2000).
Ces dernières interviennent également dans l’acquisition de nutriments. Elles peuvent dégrader la transferrine, une protéine riche en fer et présente en grande quantité dans le liquide créviculaire, afin de fournir une source de fer à la bactérie (Brochu et al., 2001; Olczak et al.,2005)
Les enzymes protéolytiques de P. gingivalis sont soit extracellulaires, sous forme soluble ou incluses dans des vésicules, soit liées à la cellule. (Kadowaki et al., 2000) Trois activités protéolytiques sont le fait de protéinases différentes:
La X-prolyl-dipeptidyl peptidase est active sur des aminopeptides, les collagénases actives sur le collagène de type I, II et III et les cystéine-protéinases (trypsin-like proteinases) aussi connues sous le nom de gingipaïnes.
Diverses protéinases de P. gingivalis ont été décrites, mais l’essentiel de l’activité protéolytique serait du aux gingipaïnes (Huang et al., 2001; Hajishengallis et al., 2006) qui représentent 85% de l’activité protéolytique totale de P. gingivalis (Bostanci et Belibasakis, 2012; How et al., 2016) et dont la fonction majeure est l’acquisition de nutriments via la dégradation des protéines en peptides (Kristoffersen et al., 2015).
Leur activité catalytique est liée à la présence d’un groupement thiol dans la cystéine de la molécule. Sur la base de leur spécificité du substrat, les gingipaïnes sont divisés en Arggingipaïne A et B (RgpA, RgpB) qui clivent la région carboxy-terminale des résidus arginine alors que la Lys-gingipaïne (Kgp) clive la région carboxy-terminale des résidus lysine (Kadowaki et al., 2000; Curtis et al., 2001; Takashi et al., 2006; How et al., 2016).
En outre, l’inactivation des défenses immunitaires locales est aussi le résultat de cette activité protéolytique, les gingipaïnes R conférent une résistance élevée aux mécanismes de défense de l’hote, où certaines immunoglobulines, des cytokines et des facteurs de complément peuvent être dégradés, contribuant ainsi à la progression et au maintien de P. gingivalis à l’intérieur de la poche parodontale (Curtis et al., 2001).

Table des matières

Introduction
Partie 1. Synthèse bibliographique
1.1. Le biofilm dentaire
1.1.1. Définition
1.1.2. Formation du biofilm
1.1.3. Classification du biofilm dentaire
1.1.4. Diversité bactériennes de la plaque sous-gingivale
1.2. Mécanismes biologiques de l’adhésion bactérienne
1.2.1. Le transport
1.2.2. L’adhésion initiale
1.2.3. L’attachement
1.3. L’espèce Porphyromonas gingivalis
1.3.1. Caractéristiques de l’espèce
1.3.2. Facteurs bactériens de virulence
1.3.3. Réponse de l’hôte
1.4. Les maladies parodontales
1.4.1. Structure du parodonte
1.4.2. Définition des maladies parodontales
1.4.3. Classification des maladies parodontales
1.5. La vitamine E
1.5.1. Définition
1.5.2. La fonction anti-oxydante de la vitamine E9
Partie 2. Matériels et Méthodes
2.1. Isolement et identification de Porphyromonas gingivalis
2.1.1. Prélèvements
2.1.2. Transport des échantillons
2.1.3. Isolement et purification de Porphyromonas gingivalis
2.1.4. Pré-identification de Porphyromonas gingivalis
2.1.5. Identification biochimique
2.1.6. Etude de la sensibilité de P. gingivalis aux antibiotiques
2.1.7. Conservation des souches isolées
2.2. Effet de certains paramètres physico-chimiques sur la croissance de P. gingivalis
2.2.1. Effet du pH sur la croissance de P. gingivalis
2.2.2. Effet de la ménadione sur la croissance de P. gingivalis
2.2.3. Effet de l’alpha-tocophérol sur la croissance de P. gingivalis
2.3. Effet de certains paramètres physico-chimiques sur les caractéristiques pariétales de P. gingivalis
2.3.1. Préparation des suspensions bactériennes
2.3.2. Détermination de l’hydrophobicité de la paroi de P. gingivalis
2.3.3. Adhésion microbienne aux solvants (MATS)
2.4. Effet de certains paramètres physico-chimiques sur l’adhésion et la formation du biofilm de P. gingivalis
2.4.1. Préparation des suspensions bactériennes
2.4.2. Adhésion et formation du biofilm sur microplaque
2.4.3. Quantification de la biomasse fixée
2.5. Etude de l’effet de l’alpha-tocophérol sur les fibroblastes gingivaux stimulés avec le lipopolysaccharide de P. gingivalis
2.5.1. Culture des cellules fibroblastiques gingivales
2.5.2. Préparation du lypopolysaccharide de P. gingivalis
2.5.3. Etude de l’effet de l’alpha-tocophérol sur la morphologie des cellules fibroblastiques stimulées ou non avec le LPS de P. gingivalis
2.5.4. Etude de l’effet de l’alpha-tocophérol sur la croissance des fibroblastes stimulés ou non avec le LPS de P. gingivalis
2.5.5. Mesure des cytokines et des peptides antimicrobiens après le contact des fibroblastes gingivaux avec l’alpha-tocophérol et le LPS de P. gingivalis
2.5.6. Migration des fibroblastes gingivaux «scratch test»
2.5.7. Analyses statistiques
Partie 3. Résultats et discussion
Conclusion
Résumé
Références bibliographiques
Annexes

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