Mise en place de processus de vérification de
la méthode PCR en temps réel selon la norme
ISO 15189 version 2012

 Vérification de méthode PCR en temps réel 

 Objectifs 

 Objectif général

 L’objectif de ce travail est de mettre en place un processus de vérification de la méthode PCR en temps réel selon la norme ISO 15189 version 2012 pour les CNR grippe et poliomyélite afin de monter le dossier de validation des méthodes des dits CNR dans le cadre de leur accréditation. 

Objectifs spécifiques 

 Mettre en place les documents à savoir : – Une procédure de vérification de méthode. – Une procédure de gestion des modifications – Et les enregistrements associés à ces procédures.  Etudier les risques selon les outils AMDEC et les 5M.  Etudier des paramètres spécifiques propres à une vérification de méthode de portée A tels que: – La répétabilité ; – La fidélité intermédiaire ; – La justesse/exactitude ; – L’incertitude type et élargie ; – La comparaison de méthode avec un équipement back up ; – La contamination inter-échantillon. IV. Cadre d’étude : Fondation Institut Pasteur de Dakar (FIPD) 

Présentation

 L’IPD est une Fondation de droit sénégalais, reconnue d’utilité publique, au Sénégal. Il est implanté sur le plateau des Madeleines au cap Manuel (Figure 06). Historique En 1896, le Docteur EMILE MARCHOUX, a créé à Saint-Louis du Sénégal le laboratoire de microbiologie de l’Afrique Occidentale Française. Le transfert à Dakar a été réalisé le 24 avril 1913. Le 2 juillet de la même année, le gouverneur William Ponty, venant visiter les bâtiments définit en ces termes les missions du laboratoire de recherche en bactériologie et zootechnie de l’Afrique Occidentale Française :«son programme d’investigation plein d’ampleur comprend la recherche et l’étude des maladies bactériennes et des maladies protozoaires de l’homme, des animaux et des plantes, l’étude de leur transmission possible ou certaine par les insectes suceurs ou piqueurs, celle des moyens de s’en préserver ou de les 17 17 détruire ainsi que l’étude des substances nouvelles ou anciennes des virus ou vaccins pouvant servir à les éviter ou à les traiter ». C’est en 1923, qu’une convention renouvelée plus tard en 1963, puis le 27 juillet 1974 a conféré à cet Institut la qualité « filiale » de l’Institut Pasteur de Paris appartenant au Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts associés. Il était considéré comme établissement poursuivant un objet de Philanthropie et d’utilité publique, autorisé à exercer des activités de santé publique et de recherche au Sénégal. Il conduit des missions de recherche (avec la découverte de vaccin de la fièvre jaune en 1927) et de santé publique, de formation et de services, ciblées sur des priorités nationales et régionales. Le 27 Mai 2010, l’Institut Pasteur de Dakar devient fondation de droit Sénégalais grâce à la signature à Dakar de ses nouveaux statuts définis par le gouvernement de la République du Sénégal et l’Institut Pasteur. Figure 6: Institut Pasteur de Dakar [14]. 18 18 IV.2. Présentation du Pôle de Virologie Le PV a été créé conformément à la résolution du conseil de fondation du 17 décembre 2014. Ce pôle comprend une unité et 3 groupes renfermant 5 centres de référence organisé comme suit : – L’unité des arbovirus et virus de fièvres hémorragiques (UAVFH) renfermant le centre collaborateur OMS pour les arbovirus et les virus des fièvres hémorragiques (CCOMS). Cette unité dispose également d’une collection de plus de 8000 souches de virus et renferme une entité de production de réactifs (Ascites immunes et antigènes) destinés aux laboratoires nationaux africains. – le Groupe « Rage et encéphalites » renfermant le CNR de la rage – le Groupe « Virus respiratoires » renfermant le CNR OMS grippe et autres virus respiratoires et le CNR OMS Rougeole – le Groupe « Virus entériques » renfermant le CNR / Laboratoire inter-pays OMS Polio Ces centres de référence ont des missions de santé publique, de recherche, d’enseignement et de formation conformément aux missions de l’Institut Pasteur avec comme activité principale la surveillance épidémiologique des maladies. Ces activités sont appuyées par d’autres activités transversales telles que la démarche qualité, des plateformes et infrastructures. Le PV a été impliqué dans plusieurs investigations des épidémies de maladies virales (CapVert, Côte d’Ivoire, République Centre Africaine, Mauritanie, Burkina Faso, Guinée, Sénégal…), ce qui lui a permis d’avoir une importante et précieuse collection de sérums (humains, singes et rongeurs). Depuis 1994, le PV développe des outils moléculaires en matière de diagnostic et de recherche et s’appuie aussi sur un laboratoire de niveau de protection 3 pour la manipulation des virus dangereux. En outre le Pôle de Virologie (PV) s’est engagé depuis plusieurs années dans une démarche qualité selon la norme ISO 9001 pour mieux satisfaire les attentes de ses clients, partenaires et son personnel. Cette démarche s’inscrit dans le respect des exigences légales et réglementaires nationales et de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Depuis 2009, des résultats significatifs pour se conformer à la norme ISO 9001 qui sert de référentiel, ont été obtenus grâce à l’engagement de tout le personnel. Ces progrès notables doivent être consolidés et amplifiés, tout en se conformant également à la norme ISO 15189 en ce qui concerne le CCOMS et les CNR. 19 19 Figure 7: Organisation des activités du PV 

Méthodologie de la vérification 

Dans cette partie nous avons décrit les différentes étapes de la mise en place du processus de vérification. 

Choix de la méthode

 Pour cela, une présentation devant le cadre scientifique a été faite pour avoir une vision globale des activités des CNR de la grippe et de la poliomyélite. Le tableau ci-dessous montre les différentes activités des CNR Grippe et Polio du PV qui utilisent une méthode CDC. C’est ainsi que nous avons choisi la méthode PCR en temps réel pour faire la vérification selon la norme ISO 15189. 20 20 Tableau II: Activités des CNR DIT : différenciation intra-typique CDC : center diseases control (centres pour le contrôle et la prévention des maladies) Ainsi après le choix de la méthode, un dossier d’accréditation a été constitué à l’aide d’une recherche bibliographique exhaustive qui est une des pierres angulaires de ce processus. 

 Etude bibliographique et rédaction documentaire 

Une étude bibliographique de la PCR en temps réel selon la norme ISO 15189 et de ses documents techniques (SH REF, SH FORM, SH GTA…) ont permis de savoir les documents essentiels à produire. L’élaboration de documents de vérification est importante car si beaucoup d’informations et de résultats sont collectés, ceux-ci doivent faire l’objet d’une exploitation statistique et d’une synthèse dans un dossier cohérent et clair, avec une acceptation formelle par un responsable désigné de la validité opérationnelle de la technique. Ainsi, il a été nécessaire de rédiger des procédures comme : la Vérification/Validation de méthodes, et la gestion des portées flexibles. De ces procédures, des formulaires d’enregistrement à savoir : la fiche de portée d’accréditation, la fiche de calcul statistique des données, bibliographie vérification/validation de méthode, compilation des résultats des caractéristiques étudiées. CNR Méthodes Qualifications Preuves Décision Grippe Détection des types et sous types des virus grippaux dans les échantillons naso pharyngés par PCR en temps réel Reconnue Kit CDC Vérification Polio Détection des entérovirus dans les selles par isolement sur culture cellulaire DIT par PCR en temps réel Reconnue Kit CDC Vérification 

Etude de risques 

L’étude des risques est primordiale pour la mise en place du processus, car il a permis de préconiser si nécessaire des actions préventives pour l’atteinte de nos objectifs. En effet, pour chaque étape d’une démarche qualité à la vérification de méthode ; il est nécessaire de dégager l’ensemble des risques susceptibles d’empêcher d’atteindre nos objectifs. La méthode des 5M, couplée à la méthode AMDEC a permis d’identifier, d’évaluer et de maîtriser l’ensemble des risques plausibles du processus. La criticité ou le risque brut a été évaluée selon la probabilité et la gravité du risque. Ces deux paramètres sont notés (voir tableau III), de même que le seuil de criticité qui est fixé par le laboratoire (seuil de criticité : 9). Ce seuil de criticité permet d’évaluer le risque, et si toutefois ce dernier est atteint ou dépassé, une étude de la maîtrise est nécessaire. Par contre si la criticité est faible c’est-à-dire inférieur au seuil ; le risque est maîtrisé. Comme la criticité, la maîtrise des risques va aussi dépendre des facteurs mis en place en interne à savoir la technique, l’organisation et le personnel (TOP). Ces derniers sont aussi côtés de façon arbitraire, et un seuil de maîtrise est fixé. Toutefois, des actions préventives seront nécessaire, si le seuil de maîtrise établit par le laboratoire est dépassé ou atteint. Au cas où le risque est maîtrisé, une surveillance est nécessaire jusqu’à la prochaine étude de risque. 

Etude des caractéristiques de la méthode 

La PCR en temps réel est une méthode quantitative et la recherche bibliographique a permis de savoir les paramètres essentiels à étudier au laboratoire (sur site). Ainsi, les CNR grippe et poliomyélite adoptent la même méthode, donc ont les mêmes caractéristiques étudiées sur site. La répétabilité Pour ce paramètre un contrôle qualité interne (CIQ) est testé 30 fois en même temps, par le même opérateur, le même équipement et au même endroit. Après obtention des résultats, on détermine la moyenne, l’écart type et le coefficient de variation (CV). Ce dernier comparé avec un CV de référence pourra nous aider à la conclusion de ce paramètre. 22 22 A noter que : – La moyenne (m) : m = Ʃ ni/N avec Ʃ= somme ; ni= valeur partielle et N= nombre total d’échantillon. – L’écart-type (ʂ) : ʂ = Ʃ [(ni-m) ²/N-1] ½ – Coefficient de variation (CV) : CV = ʂ/m×100 NB : le CV de référence est déduit à partir du CV de fidélité intermédiaire par la formule Fidélité intermédiaire = 1,33 répétabilité Soit, répétabilité = Fidélité intermédiaire / l, 33 CV répétabilité = CV reproductibilité x 0,75. [16] Note : le CV de référence a été obtenu grâce à une étude rétrospective des lots de CIQ utilisés les années précédentes (2017 jusqu’à 2019), pour chaque lot utilisé durant l’année, en prendre 30 résultats (valeur de CT) pour déterminer le CV après détermination de la moyenne et de l’écart-type. Fidélité intermédiaire Classiquement, la fidélité intermédiaire est évaluée à l’aide des coefficients de variation calculés à partir des résultats des CIQ. Les modalités de calcul sont identiques à celles de la répétabilité, avec calcul de la moyenne (m), de l’écart-type (s) et du coefficient de variation (CV) sur les valeurs expérimentales de chaque série ; le CV calculé est comparé au CV limite admissible de fidélité intermédiaire choisi au préalable (Fournisseur, SFBC…). Justesse/ Exactitude Une étude d’exactitude correspond à la comparaison du résultat d’un seul dosage d’un échantillon inconnu à une valeur cible consensuelle, alors que la justesse est l’étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur de référence (valeur vraie). En pratique il n’est pas nécessaire d’étudier le paramètre de justesse si toutefois l’exactitude est connue. Ainsi pour cette dernière ; l’étude est faite par approche c’est-à-dire, les laboratoires évaluent l’exactitude à partir des résultats des Evaluations Externes de la Qualité (EEQ) [7]. 23 23 Comparaison de méthode avec un équipement back up Elle consiste à faire des tests sur deux équipements différents avec les mêmes échantillons. Et pour chaque couple de résultat, la différence et le rapport des valeurs doivent être compris entre une valeur bien définie qui est la limite de suivi. Notons pour chaque couple retenu xi (méthode X) et yi (méthode Y) : • Calculer les différences xi – yi • Calculer les rapports yi / xi Avec une limite de suivi ± 4.24 ʂ pour chaque niveau de concentration [7]. Avec ʂ : écart-type de la fidélité intermédiaire (FI) obtenue à partir des CIQ [7]. Incertitude de mesure Nous devons déterminer le paramètre d’incertitude par un calcul en utilisant la formule de l’incertitude de répétabilité de type A, et de l’incertitude élargie. µ= ʂ/ (n) ½ Avec : – µ = incertitude de type A – ʂ = écart type de la répétabilité – n = nombre de fois ou d’échantillon µe= Қ ʂ/ (n) ½ Avec : – µe = incertitude élargie – Қ = facteur d’élargissement Contamination Une étude des contaminations inter-échantillons peut être effectuée de la façon suivante : Après rinçage de l’appareil, un échantillon à valeur élevée (ou positif fort) est analysé 2 fois consécutivement (H1, H2) suivi d’un échantillon à valeur basse (ou négatif) également analysé 2 fois. Et le constat se fera si toutefois nous aurons des faux positifs.