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MATERIEL D’ECHANTILLONNAGE

L’échantillonnage a été fait en pratiquant la pêche électrique et c’est la seule méthode de capture utilisée durant l’étude sur le terrain.
Le dispositif de pêche utilisé (Annexe III) est formé par :
• un «électro-fisher» de marque DEKA 3000 «lord» année 2002, de 12 volts de tension, d’intensité 7.6 ampères et 72 watts de puissance. Sa tension de sortie varie de 250 à 600 volts,
• un générateur formé par une batterie de marque HW,
• une anode,
• une cathode,
• des épuisettes,
• des seaux en plastique.

METHODOLOGIE

ECHANTILLONNAGE PISCICOLE

Pêche électrique

Cette méthode (Figure 3, page 9) consiste à électrocuter les poissons qui se trouvent à la portée des pêcheurs de manière à ce qu’ils perdent connaissance ou entrent dans une phase appelée «électronarcose». A ce stade, ils sont facilement capturés et ramassés avec des épuisettes.
La pêche électrique présente plusieurs avantages importants :
• grande efficacité de capture,
• maintien en vie des organismes capturés,
• conditions opératoires standardisées et reproductibles offrant une grande cohérence des résultats.

Principe

Un générateur produit un courant redressé d’intensité réglable entre 250 et 600 volts. La phase négative est mise à l’eau via une grille métallique (cathode). La phase positive est connectée à une anode de pêche (manche isolant terminé par un anneau en cuivre), qui contient le bouton marche-arrêt et qui va être manipulée par un opérateur. Une fois plongée dans l’eau et en activant le bouton marche, l’anode ferme le circuit électrique.
Un champ électrique sphérique d’intensité décroissante à mesure que l’on s’en éloigne, va rayonner autour de l’anode et influencer le comportement de tous les poissons se trouvant à l’intérieur du champ d’efficacité (Paugy & Lévêque, 2006a). L’action de ce champ varie de 1,5 a 2 mètres (Nelva et al., 1979). Les terminaisons nerveuses présentes sur les flancs des poissons (les lignes latérales) sont des récepteurs sensibles à ce stimulus.
Figure 3 : Méthode de pêche électrique
(Photo Randrianiaina, 2011)
La différence de potentiel appliquée à ces lignes latérales va déterminer une modification de comportement chez le poisson, qui va irrésistiblement nager vers le gradient de potentiel le plus élevé. C’est ce que l’on appelle la nage forcée. Une fois arrivée à proximité de l’anode, là où le champ électrique est plus élevé, le poisson entre en électronarcose. Deux autres operateurs portent chacun une épuisette de deux cotés du premier opérateur et qui va capturer les poissons en électronarcose. Une fois qu’il n’est plus soumis au champ électrique, l’animal retrouve rapidement sa mobilité et n’en garde aucune conséquence. Chaque poisson capturé a été mis dans un seau plastique contenant de l’eau.

Collecte de tissus et conservation des spécimens

Parmi les poissons capturés, quelques spécimens ont été gardés pour le prélèvement de tissus et les études morphologiques ultérieures au laboratoire (Annexe I). Les autres ont été relâchés.
Tout d’abord, les individus prévus à être conservés ont été photographiés dans un aquarium.
Avant la manipulation, les matériels utilisés (ciseaux, pinces de cochère) ont été stérilisés comme suit : nettoyés à l’aide d’un essuie tout imbibé d’alcool (90°), puis brulés quelques secondes par la flamme d’un briquet (Figure 4a). Ensuite, une portion de la nageoire pectorale droite, environ deux millimètres, a été coupée et mise dans un eppendorf numéroté contenant de l’alcool 100% (Figure 4b). Chaque numérotation contient des informations diverses dans le fiche de données utilisé (Annexe II), comme la date de capture, le nom du site, la coordonnée géographique, le nom de l’espèce capturée et les collecteurs. Puis, chaque spécimen a été aussi étiqueté au niveau de la bouche et de la branchie à l’aide d’une ficelle (Figure 4c). Chaque étiquette porte la même numérotation que l’échantillon génétique.
Figure 4 : Déroulement de la collecte de tissus
(Photos Randrianiaina, 2011)
Enfin, les spécimens ont été mis dans une solution de formol à une concentration de 10 à 35%. Il est à noter que chaque site a été photographié pour la reconnaissance mais aussi pour conserver les informations sur la description de l’habitat et les pressions qui ne sont pas évoqués dans cette étude.

ETUDE PHYLOGENETIQUE

Afin de déterminer les relations phylogénétiques, l’approche moléculaire est examinée dans cette étude. La méthode de Sanger est utilisée pour l’analyse moléculaire. Cette méthode appartient à la seconde génération de l’approche moléculaire (automatique) (Sanger & Coulson, 1975).

Méthode d’identification moléculaire

A partir des échantillons de tissus collectés, les travaux de laboratoire concernant l’identification moléculaire ont été effectués par le Docteur Roger Daniel Randrianiaina en 2012 à l’Université Technique de Braunschweig et en 2013 à l’Université Ludwig-Maximilians de Münich en Allemagne. Ces travaux se déroulent en trois étapes : l’extraction, l’amplification et le séquençage de l’ADN. L’ADN génomique total a été extrait des échantillons de tissus à l’aide de la digestion de protéinase K d’une concentration de 10 mg/ml, suivi d’un protocole d’extraction de sel standard selon Bruford et al. (1992).
Un fragment mitochondrial, d’environ 700 paires de bases, de la Cytochrome Oxydase sous unité 1 (CO1) a été amplifié en utilisant les amorces développées par Hebert et al. (2004), Ward et al. (2005) et Ivanova et al. (2006, 2007). La CO1 a été choisie en raison (1) de la disponibilité des amorces qui fonctionnent aisément pour les vertébrés (poissons inclus) et (2) de l’existence d’une base de données moléculaires énorme facilitant la comparaison des séquences obtenues.
Les produits de PCR (Polymerase Chain Reaction) ont été séparés sur un séquenceur d’ADN automatisé ABI 3130XL à l’Université Technique de Braunschweig et ABI 3730 à l’Université Ludwig-maximilians de Münich.

Analyse des séquences

Après l’obtention de la séquence d’ADN CO1, les traitements des séquences ont été faits au laboratoire génétique du DBA, sous la supervision du Docteur Roger Daniel RANDRIANIAINA et du Docteur Fanomezana Mihaja RATSOAVINA.
Avant de faire l’analyse pour la construction de l’arbre phylogénétique, deux étapes importantes sont nécessaires : la contrôle qualité et l’alignement des séquences obtenues.

Contrôle qualité

L’objectif dans cette étape consiste principalement à avoir des excellentes séquences. Elle a été effectuée sous CLC Main Workbench version 6.8.2. (http://www.clcbio.com). C’est un logiciel utilisé pour l’analyse et la visualisation des données de séquençage Sanger. Les fonctionnalités du CLC sont utilisées pour analyser les données de séquence d’ADN ou d’ARN ou bien des protéines, comme l’analyse de l’expression des gènes, la conception primaire, la clonage moléculaire, des analyses phylogénétiques, et la gestion des données des séquences.
A l’aide de ce logiciel, chaque séquence est examinée une à une. Tout d’abord, la vérification de la qualité de l’électrophoregramme et le score de qualité a été effectuée. Chaque pic de l’électrophoregramme est soutenu par un histogramme donnant le score de qualité ou la probabilité de la mise en place d’une base. Ensuite, la longueur maximale utilisable pour chaque séquence est vérifiée, pour avoir au moins 450 paires de bases. Par la suite, les mauvaises séquences ou trop courtes ont été supprimées. Enfin, chaque emplacement de bases nucléotidiques est examiné si celle-ci est réellement dans son emplacement en fonction de la ressemblance globale des séquences.
A titre d’exemple, le contrôle qualité effectué sur les séquences des individus de l’espèce G.
giuris permettant de voir les astuces à contrôler (Figure 5).

Alignements

Mega version 6 (Tamura et al., 2013) est un logiciel à usage multiple principalement pour conduire des alignements de séquences, pour construire des arbres phylogénétiques inférés, ou bien pour estimer les taux de l’évolution moléculaire, ou encore tester des hypothèses évolutives.
Ainsi, pour toute reconstruction phylogénétique, il est indispensable que les caractères (bases nucléotidiques) considérés soient homologues et indépendants (Willi, 1950). Il est donc nécessaire d’aligner les séquences au préalable, de façon à mettre en correspondance les caractères homologues.
Dans cette étape, une séquence supplémentaire de Paratilapia polleni (famille Cichlidae) a été ajoutée à la série de données afin d’enraciner l’arbre à reconstruire. Cette espèce va donc servir de groupe externe (out group). Le choix se porte à ce que l’espèce choisie est plus ou moins proche du groupe étudié.
Avant toute chose, toutes les séquences ont été alignées. Puis, les deux extrémités de l’ensemble des séquences ont été coupées pour supprimer les parties complémentaires des amorces ou les portions dont le résultat du séquençage a été mauvais (Figure 6a). Ensuite, les bases en excès ont été supprimées et les bases mal placées ont été modifiées. Ces deux manipulations ont été effectuées après une vérification sur le premier logiciel (CLC) et la ressemblance globale de toutes les séquences (Figure 6b). Et pour finir, toutes les séquences ont été réalignées (Figure 6c).

Aperçu de l’identité des séquences étudiées

L’idée, c’est de savoir la correspondance des séquences étudiées en les comparants avec la base de données de GenBank. C’est une base de données en libre accès comprenant toutes les séquences nucléotides publiquement disponible. Le BLAST rubrique Nucléotide (Basic Local Alignment Search Tool rubrique Nucleotid) disponible sur le site NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) a été utilisé. Chaque séquence d’ADN a été entrée dans le site, puis le BLAST est exécuté. Par cette méthode, le site donne plusieurs séquences correspondantes à celle qui a été entrée. Chaque séquence va donc s’aligner avec celles qui sont les plus similaires des séquences du gène du Cytochrome Oxydase sous unité I (CO1) présentes dans GenBank. Ces séquences correspondantes à celle qui a été entrée présentent différents pourcentages de similitude. Mais la séquence qui présente la plus grande similitude (pourcentage élevé) a été retenue. Les séquences plus similaires des espèces, obtenues dans GenBank, vont être incluses dans la reconstruction de l’arbre phylogénétique afin de fixer la nomination des individus étudiés.

Modèle d’évolution

Pour la reconstitution d’un arbre phylogénétique, l’étape la plus importante est de trouver un modèle évolutif (modification des séquences) des séquences d’ADN alignées (Harrison & Langdale, 2006). Le modèle d’évolution consiste à savoir la vitesse de changement des molécules d’acide nucléique (A, C, G et T) dans une population considérée pour une génération quelconque. Afin de déterminer le modèle d’évolution moléculaire le plus approprié, MrModeltest (Nylander, 2004) en liaison avec PAUP 4.0 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) (Swofford, 2003), a été utilisé. MrModeltest est un utilitaire spécialement conçu pour la comparaison des différents modèles d’évolution d’ADN alors que PAUP est un programme d’analyse phylogénétique en utilisant la parcimonie, le maximum de vraisemblance, et les méthodes de distance (Swofford, 2003)
Par ces deux logiciels, le Modèle GTR+1 (General Time Reversible) a été estimé le plus approprié d’après le critère AIC (Akaike Information Criterion) pour les séquences étudiées. Le modèle GTR (General Time Reversible) est un modèle décrit par Tavaré (1986). C’est un modèle neutre (la sélection ne fonctionne pas sur les substitutions des nucléotides) et indépendant (les changements dans un site – emplacement d’une base – ne touchent pas la probabilité de changements dans un autre site). Ce modèle considère aussi un nombre fini de site. Par conséquent, sur l’évolution, un site peut ou n’est pas changé ou modifié à plusieurs reprises au cours de l’évolution.
L’AIC est une estimation de la quantité d’information perdue lorsqu’un modèle est utilisé afin de satisfaire le critère de parcimonie (Cameron & Trivedi, 2005). Le choix du modèle réside donc sur un modèle ayant la plus faible AIC qui fournit de ce fait un meilleur ajustement aux données (Akaike, 1974).

Reconstruction de l’arbre phylogénétique ou cladogramme

Les analyses phylogénétiques ont été effectuées à l’aide du logiciel «Mr. Bayes» version 3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) afin de calculer les probabilités postérieures de l’arbre phylogénétique inféré. La méthode cladistique utilisée est la reconstruction phylogénétique du maximum de parcimonie. Le principe de parcimonie stipule que pour différentes recombinaisons possibles des arbres générés par l’analyse, celui qui présent le chemin le plus court pour les changements existant présente la plus grande probabilité et qui est retenue (Sullivan & Swofford, 2001).
Cette méthode cladistique est basée sur l’évolution des caractères qui sont les bases nucléotidiques formant les séquences d’ADN. En principe, le cladogramme est reconstruit à partir de l’analyse de ces caractères visant à identifier l’état plésiomorphique (primitifs) et l’état apomorphique (dérivés) (Willi, 1950). Il est basé sur l’identification des caractères dérivés de l’état primitif partagé par deux ou plusieurs groupes d’individus ou caractères synapomorphes qui le rend monophylétique. Au niveau des séquences, la source de cette caractère est appelée site informatifs (Figure 6c, page 13). C’est un ensemble de sites où il y a des bases modifiées partagées par deux ou plusieurs séquences d’ADN. La construction de l’arbre se fait uniquement à partir de ces sites informatifs en parcimonie.
Les paramètres par défaut du logiciel ont été gardés pendant la procédure sauf pour le Ngen (nombre de génération) modifiée à 5.000.000 de générations, printfreq (impression des procédures d’analyse sur l’écran) changée à une impression toutes les 1 000 générations et burning (enlèvement d’un pourcentage quelconque des arbres générés au début de l’analyse) modifié à enlever 25% des arbres généré au début de l’analyse.
Dans un premier temps, le logiciel génère tous les arbres possibles pour chaque génération. Puis, de tous ces arbres, le principe de parcimonie intervient. Ce principe vise à ne conserver que les arbres les plus parcimonieux, c’est-à-dire le plus court en nombre de changement. En suite, une topologie d’arbre toutes les 100 générations est échantillonnée au hasard. En 15 principe, il y a donc 37.500 arbres pour les 5.000.000 générations considérées. Enfin, la dernière étape effectuée par le logiciel consiste à construire un arbre de consensus à partir des topologies d’arbres existantes.

ETUDE MORPHOLOGIQUE

Une étude morphologique générale et biométrique ainsi qu’un comptage des rayons de nageoires ont été faits sur chaque spécimen capturé et conservé au Laboratoire de Biologie des Populations Aquatiques (LBPA) du Département de Biologie Animale (DBA). La fiche de données utilisée avec les différents caractères morphologiques considérés est présentée en Annexe II.

Morphométrie et méristique

L’étude biométrique consiste à faire des différentes mensurations sur le corps des spécimens à l’aide d’un pied à coulisse (Annexe III). Les paramètres morphométriques considérés ont été basés suivant Banister (1994), Paugy et al. (2003) et Sparks & Nelson (2004).
Au total, 33 mensurations ont été effectuées sur chaque spécimen (Tableau 2, page 16 et 17; Figure 7, page 18).

Table des matières

INTRODUCTION
Premier partie: PRESENTATION DES SITES D’ETUDES
Deuxième partie: MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIEL BIOLOGIQUE
II.2. MATERIEL D’ECHANTILLONNAGE
II.3. METHODOLOGIE
II.3.1. ECHANTILLONNAGE PISCICOLE
II.3.1.1. Pêche électrique
II.3.1.2. Principe
II.3.1.3. Collecte de tissus et conservation des spécimens
II.3.2. ETUDE PHYLOGENETIQUE
II.3.2.1. Méthode d’identification moléculaire
II.3.2.2. Analyse des séquences
a. Contrôle qualité
b. Alignements
II.3.2.3. Aperçu de l’identité de séquences étudiées
II.3.2.4. Modèle d’évolution
II.3.2.5. Reconstruction de l’arbre phylogénétique ou cladogramme
II.3.3. ETUDE MORPHOLOGIQUE
II.3.3.1. Morphométrie et méristique
II.3.3.2. Construction du dendrogramme morphologique ou phénogramme
II.3.4. ANALYSES STATISTIQUES DES DONNEES
II.3.4.1. Détermination de caractères distinctifs entre les espèces
II.3.4.2. Etude des relations entre les caractères morphologiques examinés
TROISIEME PARTIE: RESULTATS ET INTERPRETATIONS
III.1. PRESENTATION GENERALE DE L’ETUDE
III.2. ANALYSE PHYLOGENETIQUE
III.2.1. APERÇU DE L’IDENTITE DES SEQUENCES OBTENUES
III.2.2. ARBRE PHYLOGENETIQUE OU CLADOGRAMME
III.3. ETUDE MORPHOLOGIQUE
III.3.1. DESCRIPTION MORPHOLOGIQUE
III.3.2. DENDROGRAMME MORPHOLOGIQUE OU PHENOGRAMME
III.4. ANALYSES STATISTIQUES
III.4.1. CARACTERES DISTINCTIFS ENTRE LES ESPECES
III.4.2. RELATION ENTRE LES CARACTERES MORPHOLOGIQUES EXAMINES
QUATRIEME PARTIE: DISCUSSION
IV.1. CADRE GENERAL DE L’ETUDE
IV.2. MORPHOLOGIE DES ESPECES ETUDIEES
IV.3. SYSTEMATIQUE ET EVOLUTION
IV.4. SYSTEMATIQUE ET DISTRIBUTION
IV.5. STATUT IUCN ET CONSERVATION
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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