Rôle de la protéine HMGB1 dans la stéatose hépatique associée à l’obésité

Effet de la délétion d’HMGB1 hépatocytaire dans la progression de la stéatose

Afin d’induire le développement d’une stéatose hépatique, les souris sont nourries avec un régime hyper lipidique contenant 60% de lipides (HFD60%) pendant 12 semaines. Dans ce contexte, la délétion d’HMGB1 ne modifie pas la prise de poids au cours de ce régime, ni la tolérance au glucose mesurée lors d’un OGTT (Données non montrées). Le ratio poids de foie-poids de corps (Fig 34A) n’est pas significativement modifié même si on peut noter une légère augmentation chez les HMGB1Δhep. Par contre, en immunohistochimie, les coupes de foies des animaux délétés pour HMGB1 présentent une multiplication par 3 (p=0.059) du marquage à l’huile rouge (Fig 34B), ce qui suggère que la délétion d’HMGB1 augmente la quantité de lipides neutres présents dans le foie. La quantification par chromatographie gazeuse des espèces lipidiques (Fig 34C) indique aussi une augmentation significative de la quantité relative d’esters de cholestérol (p=0.0089). Cependant, la proportion relative des autres espèces comme les TG, les DG ou le cholestérol est inchangée. L’augmentation de la stéatose est corrélée à une augmentation de l’expression, dans les foies des animaux HMGB1Δhep comparativement aux animaux HMGB1fl/fl, de marqueurs géniques impliqués dans le stockage (Cd36 : p=0.003 et Cidec) et la synthèse (Fasn : p=0.002, Scd1 : p=0.002 et Pparg) des lipides (Fig 34D). De façon intéressante, ces modifications d’expression géniques sont associées à une diminution d’expression de marqueurs impliqués dans l’utilisation des lipides, notamment Fgf21 (p=0.0148) (Fig 34D). L’augmentation de la stéatose n’est pas associée à une modification du métabolisme des lipoprotéines, en effet, l’activité de la protéine de transfert microsomale (Fig 34E) est identique entre les deux génotypes. En revanche, les animaux HMGB1Δhep présentent une augmentation significative (p=0.0183) de l’export des VLDLs mesuré suite à injection de tyloxapol (Fig 34F). Cette augmentation de l’export peut être vue comme un effet compensatoire à l’accumulation de lipides dans le foie. L’augmentation de la stéatose n’est pas non plus liée à une modification de la prise alimentaire (Fig 34G, gauche), de l’utilisation des substrats puisque le respiratory exange rate (RER) est identique (Fig 34G, centre) ou de la thermogenèse (Fig 34G, droite) mesurés par calorimétrie indirecte. De manière à exclure tout effet artefactuel lié à l’utilisation du HFD60%, nous avons aussi étudié l’impact d’HMGB1 sur la progression de la stéatose hépatique induite par d’autres challenges nutritionnels comme un HFD60% de 20 semaines, un HFD60% + High Fructose (HFD60%+HS20%) de 12 semaines, un régime cétogénique de 8 semaines ou un CDHFD45% de 28 semaines (Fig 35). Malgré la diversité des substrats et des voies de signalisation mises en jeu dans ces différents challenges, les souris HMGB1Δhep présentent de façon consistante une augmentation significative de la stéatose hépatique comparativement aux souris HMGB1fl/fl . 

Conséquence physiopathologique de la délétion d’HMGB1 dans les hépatocytes

Chez le patient obèse, la principale altération fonctionnelle rencontrée au cours de la progression de l’obésité et de la stéatose est la perte de sensibilité à l’insuline. Pour évaluer si la délétion d’HMGB1 pouvait induire de telles dysfonctions nous avons mis des souris HMGB1fl/fl et HMGB1Δhep en régime HFD60% pendant 20 semaines. Cette durée, plus longue que la précédente, est connue pour générer des perturbations du signal insulinique dans les tissus périphériques dont le foie. Après 20 semaines de régime HFD60% et comme attendu, les animaux HMGB1fl/fl en régime HFD60% présentent une diminution significative de la phosphorylation d’AKT suite à une injection d’insuline comparativement au animaux en NCD dans le foie, muscle gastrocnémien et le tissu adipeux périgonadique (PG) (données non montrées). Ce résultat suggère que, comme classiquement décrit dans la littérature, le régime HFD60% pendant 20 semaines permet d’induire une résistance à l’insuline dans les tissus périphériques. En revanche, les animaux HMGB1Δhep, comparativement aux contrôles HMGB1fl/fl présentent une diminution de la signalisation insuline mesurée par une diminution de la phosphorylation d’AKT d’environ 50% (p=0.043), en réponse à une stimulation aigue à l’insuline, spécifiquement au niveau du foie (Fig 36A) puisque la phosphorylation d’AKT est identique dans le muscle gastrocnémien et le PG des souris HMGB1fl/fl et HMGB1Δhep. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de la stéatose hépatique induite par la délétion d’HMGB1 est associée à une diminution de la sensibilité de la voie de signalisation à l’insuline dans le foie spécifiquement. Pour confirmer cette hypothèse in vivo, nous avons mesuré la production hépatique de glucose (PHG), dont l’augmentation correspond à un des traits caractéristiques de la résistance à l’insuline hépatique. Pour cela, nous avons réalisé un test de tolérance au pyruvate (PTT), qui est le test de référence chez la souris pour la mesure de la PHG. Lors du PTT (Fig 36B), l’aire sous la courbe des individus HMGB1Δhep est significativement augmentée (p=0.048) comparativement aux individus HMGB1fl/fl . Lors d’un jeûne long (16 heures), la glycémie des souris HMGB1Δhep est significativement augmentée comparativement aux souris HMGB1fl/fl (Fig 36C), passant de 150 mg/dL à 200mg/dL. Pris ensemble, ces deux résultats suggèrent que la délétion d’HMGB1 augmente la production hépatique de glucose. La quantité de glycogène hépatique est aussi un indicateur de la sensibilité hépatique à l’insuline, en effet, cette hormone favorise l’entrée du glucose dans l’hépatocyte et son stockage sous forme de glycogène, contribuant ainsi à la diminution de la glycémie. Après sacrifice, le contenu hépatique en glycogène a été mesuré par un marquage à l’acide périodique de Schiff (Fig 36D). Les animaux HMGB1Δhep ont une quantité de glycogène hépatique diminuée d’environ 25% comparativement aux animaux contrôles. Pris tous ensemble, ces résultats suggèrent que lors d’un régime hyper lipidique au long cours, la délétion d’HMGB1 favorise l’apparition d’une insulino-résistance hépatique spécifiquement.  

Rôle d’HMGB1 hépatocytaire dans l’activité des voies de LDN et de β-oxydation

Les résultats obtenus précédemment laissent suggérer que la délétion d’HMGB1 pourrait favoriser la progression de la stéatose. Nous pensons, au vu des résultats précédents, que cette augmentation de B.  stéatose pourrait être due soit à une augmentation de l’activité de la LDN soit à une diminution de la β-oxydation. Pour valider cette hypothèse nous avons mis en place, en collaboration avec l’équipe de Cédric Moro et Dominique Langin au sein de l’institut, une mesure de l’activité des voies de la LDN et de la β-oxydation dans des cultures primaires d’hépatocytes murins. La mesure de l’activité de la LDN sur des hépatocytes primaires montre que, même à l’état basal, les hépatocytes issus de souris HMGB1Δhep ont une activité de la LDN significativement supérieure aux hépatocytes issus de souris contrôles. Comme attendu, cette différence est potentialisée par l’ajout d’insuline dans le milieu de culture (Fig 37A). L’activité de la LDN dans des hépatocytes issus de souris nourries avec un régime HFD60% pendant 20 semaines (Fig 37B) est significativement augmentée à l’état basal, cependant, dans ce contexte de stéatose, l’action de l’insuline est perdue, ce qui pourrait s’expliquer par une insulino-résistance induite par le régime. Afin de confirmer ces résultats in-vitro nous avons mesuré l’activité de la LDN in-vivo dans des animaux sous régime standard (Fig 37C). Ici la mesure de la LDN se fait par comptage de l’activité contenue dans les lipides neutres 1 heure après l’injection de glucose tritié dans des animaux mis à jeun pendant 6 heures. Suite à l’injection de glucose tritié chez des animaux en régime standard, nous observons une activité significativement augmentée spécifiquement dans les lipides hépatique issus de foies de souris HMGB1Δhep (p=0.0317) confirmant les résultats obtenus sur hépatocytes isolés. Nous avons aussi tenté de mesurer l’activité de la LDN in vivo chez des animaux nourris en HFD60% pendant 20 semaines mais sans résultats probants (Fig 37D). Au cours de cette mesure nous avons utilisé le même protocole que pour des souris en normal diet sans prendre en compte la variation du volume de dilution du traceur, ce qui pourrait expliquer l’absence de résultats concluants. Nous sommes actuellement en train de continuer la mise au point de la mesure de la LDN in vivo sur souris obèses. In vitro, l’oxydation du palmitate, reflet de l’activité de la β-oxydation, n’est pas différente entre des hépatocytes issus de souris HMGB1fl/fl ou de souris HMGB1Δhep et ce, quel que soit le régime (Fig 37E, NCD et Fig 37F HFD60% 20 semaines). Afin de confirmer ces résultats in vivo nous avons mesuré, par qPCR après une mise à jeun de 24 heures, la cétonémie et la glycémie. Comme attendu, les souris HMGB1fl/fl et HMGB1Δhep présentent une augmentation drastique du niveau des corps cétoniques et une diminution sévère de la glycémie comparativement aux souris nourries, mais aucune différence significative n’est observée entre les souris HMGB1fl/fl et HMGB1Δhep après 24h de jeûne (Fig 37G).