Rôle des polynucléaires neutrophiles FcεRI+ dans la pathogénie du paludisme de réanimation

Technique d’isolement et de numération des polynucléaires neutrophiles 

 Dès réception des tubes de sang, le sang total est déposé lentement sur 4 à 5 ml de Ficoll. Il faut impérativement éviter de mélanger les deux solutions. On centrifuge à 1 500 rpm pendant 30 minutes à 20°C. On récolte ensuite le buffycoat qu’on traite avec une solution de lyse pendant 8 minutes à 4°C. Après élimination de la solution de lyse (centrifugation pendant 5 minutes à 1500 rpmet à 4°C), on récupère le petit culot blanchâtre de PNN, qu’on lave deux fois avec de la solution deRPMI/Ps/L-Glu. Pour la numération, le culot de PNN est ramené à un volume de 2ml avec la solution de lavage. On procède à une dilution au 1/100e dans du bleu trypan. On compte ensuite les cellules sur les lames Kova au microscope via l’objectif 10 et 40.

Technique de marquage des polynucléaires neutrophiles

 Après numération, les cellules sont ramenées à 1.106 cellules/100 µl. Quatre tubes sont préalablement préparés.On prend 50 µl de suspension de cellules par tube, soit 500 000 cellules. Trois mixtes sont préparés parallèlement, contenant : Mixte Isotype = 10 µl IgG1 FITC, 10 µl IgG1 PerCP, 10 µl IgG1 PE et 10 µl IgG2a APC. Mixte 1 = 10 µl CD16 Alexa, 10 µl CD49 FITC, 10 µl FcεRI PE, 10 µl CD203 PerCP Mixte 2=10 µl CD16 Alexa, 10 µl CD49 FITC, 10 µl IgE PE, 10 µl CD203 PerCP Figure 4 : Choix des marqueurs CD pour l’identification des PNN On ajoute 5 µl de SAB décomplementé pour bloquer les sites non spécifiques. On incube pendant 15 minutes à 4°C. Après incubation, on ajoute : Anti human IgE (epsilon) Anti human FcεRIα Anti human CD16 Anti human CD49d (Eosinophiles) Anti human CD203c (basophiles) Autres cellules: basophiles & éosinophiles Polynucléaires neutrophiles recherchés  10 µl de PBS 1X dans le tube 1 ;  10 µl de mixte isotype dans le tube 2 ;  10 µl de mixte 1 dans le tube 3 ;  10 µl de mixte 2 dans le tube 4. On incube à nouveau pendant 30 minutes sur la glace à 4°C et à l’abri de la lumière. Ensuite, on lave deux fois avec 500 µl de PBS 1X – BSA 1%. Le culot est récupéré dans 300 µl de solution de fixation (PBS 1X – BSA 1% – PAF 1%) qu’on incube pendant 15 à 20 minutes à la température ambiante à l’abri de la lumière.Après centrifugation à 1800 rpm pendant 5 minutes, le culot est repris dans 1 ml de PBS 1X

 Lecture par la cytométrie en fluxet analyse Flow Jo 

Encore appelée FACS (fluorescence associated cell sorting), elle permet d’analyser et de trier des cellules en fonction de divers paramètres (taille, granulosité, fluorescence), en un temps relativement court. Figure 5: Procédures de détermination des proportions de polynucléaires exprimant FcεRI (a) ou IgE(b) avec le logiciel Flow Jo

Analyses statistiques

Nos données ont été analysées grâce au logiciel Statview®Version5.1.0. Les comparaisons de pourcentage d’expression de FcεRI et d’IgE par les PNN en fonction des différents groupes ont été effectuées grâce aux tests non paramétriques de Mann–Whitney. La recherche de corrélation a été faite par le test des rangs de Spearman. Une valeur de P < 0,05 est considérée comme significative. 

Caractéristiques de la population d’étude 

Le Tableau III résume les données générales ainsi que les caractéristiques hématoparasitologiques de notre population d’étude. Cette dernière est composée de 23 patients hospitalisés pour un accès palustre grave, de 13 personnes atteintes de paludisme simple et de 18 témoins indemnes de paludisme.Dans les groupes d’étude, la sex-ratio est en faveur des hommes. La moyenne d’âge est comprise entre 28–38 ans. L’analyse des données hématoparasitologiques montre des variations statistiquement significatives entre les différents groupes. En effet, suivant la gravité, il existe une différence statistiquement quant aux taux des plaquettes (P = 0,008), des polynucléaires neutrophiles (P = 0,08), des polynucléaires éosinophiles (P = 0,04), de l’hématocrite (P =0.03) de globule rouge (P = 0.04) et de globule rouge (P = 0.04) Par contre, il n’existe pas de différence significative quant à la parasitémie, aux taux d’hémoglobine, de polynucléaire basophile, des lymphocytes et de monocyte. En tenant compte des groupes de paludisme simple et des témoins indemnes de paludisme, on note une différence significative quant aux taux d’hématocrite (P = 0.05), de globule rouge (P = 0.001) et de polynucléaire neutrophile (P = 0.03). Mais nous ne notons pas de différence significative par rapport aux autres paramètres.