Amélioration de la croissance et de la production fruitière de Ziziphus mauritiana Lam. par l’inoculation mycorhizienne

Marqueurs génétiques 

Diversité interspécifique 

La biologie moléculaire est nécessaire pour caractériser les espèces fongiques directement associées aux plantes (Helgason et al., 99 ; Clapp et al., 2). Afin d’accéder à la diversité des CMA en milieu naturel, les recherches se sont basées sur l’amplification directe des marqueurs moléculaires à partir de l’ADN environnemental. Historiquement, les gènes codant pour l’ARN des sous-unités de ribosome (LSU et SSU) se sont imposés comme des marqueurs phylogénétiques de premier choix (Woese & Fox, 77 ; Long & Dawid, ). La région ITS a été proposée comme marqueur général pour les champignons (Schoch et al., ). Toutefois, elle est généralement considérée comme hypervariable à l’intérieur des espèces de CMA et possède une faible résolution parmi les espèces pour certains groupes comme les Gigasporaceae (Redecker et al., 97). Les CMA peuvent être détectés in planta grâce à la majorité des approches actuelles ciblant les gènes ARNr nucléaires (Helgason et al., 98 ; Wubet et al., 6 ; Lee et al., 8 ; Krüger et al., 9). Cette procédure fournit une évaluation des taxa de CMA qui sont présents dans les racines formant vraisemblablement la mycorhize active, par opposition aux spores dans le sol qui peuvent être en dormance (Sanders, 4). Ainsi, les premières amorces ciblant la SSU des CMA ont été VANS1 (Simon et al., 92) et le couple d’amorces AM1-NS31 (Helgason et al., 98). Au même moment, l’amplification partielle du gène LSU a été possible puisque l’ADN qui code pour l’ARNr 5.8S a pu être amplifié grâce aux amorces ITS1, ITS4, NS5 (White et al., 9 ; Sanders et al., 95 ; Redecker et al., 97 ; Redecker et al., 99). Le S est le marqueur moléculaire le plus largement utilisé pour les études moléculaires ciblant spécifiquement les CMA (Öpik et al., ; Kivlin et al., ; Davison et al., ; Öpik et al., ). L’un des avantages majeurs du S est qu’il est possible avec ce marqueur de comparer un très grand nombre de séquences entre elles grâce à la disponibilité d’un nombre croissant et très élevé des séquences de ce gène, entières ou partielles, dans les bases de données publiques. Cependant, le S n’est pas très résolutif pour distinguer les CMA phylogénétiquement très proches ou faisant partie de la même espèce. Par exemple, ce marqueur a un faible pouvoir résolutif chez les Gigasporaceae et Diversisporaceae (Hart et al., ). La méthode classiquement utilisée consiste à cloner et séquencer le S de chaque clone. Les banques ainsi construites, riches de plusieurs dizaines ou centaines de clones, sont supposées être représentatives de la diversité spécifique du gène amplifié à partir de l’ADN environnemental, et donc par extension, de la communauté présente dans l’échantillon environnemental. La technique associant clonage et PCR-RFLP permet également d’étudier la structure des communautés mycorhiziennes complexes directement à partir d’échantillons de racines (Clapp et al., 95 ; Helgason et al., 98 ; Redecker, b). Elle a souvent été utilisée avec succès pour tester si des plantes co-existantes sont préférentiellement colonisées par un taxon particulier (Helgason et al., 98, 99, 2 ; Vandenkoornhuyse et al., 2, 3 ; Öpik et al., 3 ; Mummey et al., 5). Cependant, la PCR gigogne (nested PCR) de la LSU de l’ADNr peut être appliquée avec succès pour détecter les espèces de CMA colonisant les racines des plantes (van Tuinen et al., 98 ; Jacquot et al., ; Kjøller & Rosendahl, ) et étudier la diversité des CMA au champ (Jacquot-Plumey et al., 1 ; Turnau et al., 1). Figure 6. L’emplacement de différentes combinaisons d’amorces sur des régions-cibles d’ADNr. La longueur du fragment amplifié est d’environ 5, 56, et pb respectivement avec les couples d’amorces NS31-AM1, NS31-AML2, AML1-AML2 et SSUmCf-LSUmBr (Krüger et al., 9 ; van Geel et al., ). ITS1 ITS2 .Plusieurs études ont appliqué des amorces de l’ADNr pour évaluer la diversité et la coexistence des CMA dans les racines des plantes (Helgason et al., 98, 99 ; Daniell et al., 1 ; Vanderkoornhuyse et al., 2). Ces études ont montré une certaine préférence des plante-hôtes vis-à-vis des CMA (Helgason et al., 2 ; Vanderkoornhuyse et al., 2). Helgason et al. (98) ont conçu une amorce AM1 spécifique aux CMA à partir de séquences SSU de l’ADNr, couplée avec l’amorce NS31 spécifique aux eucaryotes. Ce couple d’amorces NS31-AM1 a été utilisé avec succès pour étudier les communautés de CMA dans plusieurs écosystèmes (Vandenkoornhuyse et al., 3 ; Helgason et al., 7 ; Liu et al., 9 ; Öpik et al., 9 ; Xiang et al., ). Mais il a été montré que l’amorce AM1 ne pouvait pas détecter certaines espèces des Paraglomerales et Archaeosporales (Lee et al., 8) et dans certaine circonstance, elle pourrait amplifier des séquences non affiliées aux Gloméromycètes (Liu et al., 9). Pour améliorer la spécificité et le recouvrement des amorces PCR des CMA, plusieurs nouvelles amorces et couples d’amorces ciblant la région SSU de l’ADNr ont été développées au cours des dernières années. Par exemple, Lee et al. (8) ont construit une nouvelle paire d’amorces (AML1-AML2) avec une spécificité et un recouvrement plus élevés que le couple NS31-AM1. Liu et al. () ont combiné NS31 avec AML2 en les utilisant avec succès dans la détection des communautés de CMA à partir d’échantillons de racines. Cependant, certains auteurs ont suggéré que l’inclusion des régions ITS et LSU de l’ADNr pourrait largement améliorer la résolution au niveau de l’espèce (Krüger et al., 9). Sur cette base, Krüger et al. (9) ont défini 4 amorces (SSUmAf, SSUmCf, LSUmAr et LSUmBr) qui couvrent une partie de la SSU, la région entière de l’ITS et des régions partielles de la LSU (Figure 6). Toutes ces amorces mentionnées ci-dessus ont été fréquemment utilisées pour détecter les communautés de CMA au champ, mais deux questions se posent : (i) quelle est la meilleure paire d’amorces ? (ii) est-ce que différents couples d’amorces donnent des communautés de CMA distinctes ? Toutefois, des travaux ont montré que parmi 6 paires d’amorces spécifiques aux Gloméromycètes testées, seul le couple NS31/AML2 correspondait parfaitement à toutes les séquences de Gloméromycètes en montrant le plus grand nombre de lectures en termes de spécificité et de taux de couverture (van Geel et al., ). Ainsi, le choix des amorces détermine les résultats d’une étude de communautés de CMA et les conclusions qu’on en tire. Dans les sols cultivés par exemple, Hijri et al. (6) ont trouvé une diversité de CMA plus élevée que celle trouvée précédemment par Helgason et al. (98) et Daniell et al. (1). Ces derniers utilisaient la paire d’amorces AM1-NS31, qui est réputée pour ne détecter que certains groupes de CMA comme la famille des Glomus groupe (A) (Redecker et al., b). Hijri et al. (6) avaient le mélange d’amorces développées par Redecker (b) qui détecte une très large proportion de CMA. Mais il est aussi possible qu’il y ait des espèces de CMA présentes dans les racines ou dans le sol qui ne soient pas détectées par les méthodes utilisées actuellement (Daniell et al., 1). 

 Diversité intraspécifique

Afin d’étudier la diversité intraspécifique, des gènes en général en simple copie dans le génome, ont été proposé (Schoch et al., ). Trois d’entre eux ont été utilisés en phylogénie des champignons : le gène codant pour le facteur d’élongation 1 alpha et les gènes RPB1 et RPB2 codant pour des sous-unités de l’ARN polymérase II (Helgason et al., 3 ; Tanabe et al., 4 ; James et al., 6). Bien que l’ITS soit le code-barre génétique universel chez les champignons, c’est le gène RPB1 qui a été sélectionné comme code-barre secondaire des champignons (Schoch et al., ). En effet, ce marqueur a pour avantage de ne pas présenter de polymorphisme au sein des isolats de CMA, ce qui facilite la distinction d’espèces proches chez les CMA (Redecker & Raab, 6). Ce gène a un pouvoir de résolution spécifique supérieur à celui de l’ITS chez les champignons testés (Schoch et al., ) même si le nombre de séquences de référence est jugé insuffisant pour le moment. Récemment, Stockinger et al. () ont développé des mélanges d’amorces spécifiques du gène RPB1, avec une très haute spécificité, permettant d’amplifier tous les CMA testés (Figure 7). Les amplicons obtenus avec ces amorces sont d’une longueur approximative de 7 pb. Par ailleurs, le gène nucléaire de la mitochondrie codant pour la grande sous-unité de l’ARN ribosomal (mtLSU) a été également identifié comme marqueur moléculaire chez les CMA (Raab et al., 5). Afin d’étudier avec précision la structure des populations de Rhizophagus irregularis à partir de racines colonisées, une méthode d’amplification du mtLSU par PCR gigogne a été développée par Börstler et al. (8). Pour différencier des haplotyes au niveau intraspécifique et étudier la structure et la répartition des populations de R. irregularis au champ, Börstler et al. () ont pu montrer que ce marqueur moléculaire présente un polymorphisme au sein de l’espèce. Figure 7. Schéma représentant la structure du gène RPB1 amplifié par les couples d’amorces de PCR gigogne utilisées par Stockinger et al. (). 

Méthodes de séquençage haut-débit 

Bien que le clonage et le séquençage de Sanger aient permis de détecter et d’identifier les CMA sin situ sans avoir besoin de caractéristiques morphologiques reconnaissables, l’apparition récente d’une deuxième génération des techniques de séquençage, appelée séquençage massif ou nouvelle génération de séquençage (Next-Generation Sequencing [NGS]) a bouleversé cette approche non seulement par le très grand nombre de séquences obtenues à moindre coût, mais par l’économie de l’étape de clonage supposée associée à différents biais. Il existe plusieurs techniques de séquençage haut-débit telles que le 4 GSFLX (4 Genome Sequencer FLX) de l’entreprise Roche Diagnostic Corporation, la technologie illumina de Illumina Incorporation ou encore les systèmes SOLiDTM promus par Applied Biosystems TM. L’introduction du séquençage massif d’échantillons d’ADN provenant directement de l’environnement a révolutionné notre capacité à explorer la diversité microbienne et a permis aux chercheurs de dévoiler une diversité encore insoupçonnée. Pour ce faire, on séquence uniquement certaines régions génomiques d’intérêt taxonomique comme les régions ITS, S (procaryotes) et S (eucaryotes) des ARN ribosomaux. De nombreux logiciels et outils bioinformatiques consacrés aux traitements de données NGS ont vu le jour. Nous pouvons citer comme exemple les logiciels Mothur (Schloss et al., 9), Qiime (Caporaso et al., ) ou encore DIYA (Stewart et al., 9) mais il en existe d’autres. Du point de vue pratique, toutes les méthodes de NGS reposent approximativement sur le même principe (Shendure & Ji, 8) (Fgure 8A). On ne séquence plus un fragment simple d’ADN, mais un mélange complexe, allant jusqu’à un génome entier. Ce mélange est fragmenté et les fragments sont ligaturés à de courtes séquences universelles (adaptateurs) constituant une banque (library). Chaque molécule est amplifiée localement, dans une émulsion (ePCR : 4/Roche) ou in situ sur une lame (Illumina). 

Technologie 4 Life Sciences

 Le système de pyroséquençage Roche/4 a été la première technologie de séquençage de nouvelle génération introduite sur le marché en 5 (Figure 8B) (Margulies et al., 5). Après fragmentation de l’ADN par nébulisation, les fragments sont sélectionnés par la taille puis chaque fragment est fixé individuellement à une nanobille grâce à des adaptateurs spécifiques. Ces billes sont placées dans une émulsion permettant l’amplification des fragments en parallèle par PCR (Polymerase Chain Reaction). Chaque bille est ensuite déposée dans un puits sur une plaque de picotitration et les réactions de séquençage ont lieu simultanément dans chacun des puits. Pendant le pyroséquençage, chaque cycle se compose de l’introduction d’un type unique de nucléotides. Pendant le pyroséquençage, chaque cycle se compose de l’introduction d’un type unique de nucléotides. L’incorporation d’un nucléotide complémentaire par la polymérase, au sein du brin néosynthétisé dans l’un des puits, libère un groupe pyrophosphate. Ce groupe pyrophosphate va être converti en ATP par une ATPsulfurylase à partir d’APS (adénosine 5’phosphosulfate). Finalement, un signal lumineux sera produit par l’enzyme luciférase lors de l’oxydation de la luciférine en oxyluciférine. Cette réaction est rendue possible par la présence d’ATP. Le signal lumineux sera alors capté par une caméra à transfert de charge (CCD) capable de détecter la position de la lumière émise. On peut ainsi en déduire la séquence à partir d’une succession de pics de signaux lumineux (pyrogramme). 

 Technologie CRT Solexa/illumina 

Solexa est la seconde technologie NGS apparue sur le marché (Figure 8C) (Bentley et al., 8). Les brins d’ADN sont fragmentés aléatoirement par nébulisation et des adaptateurs sont fixés à chaque extrémité des fragments. Pour cette technologie, l’amplification des fragments se fait en phase solide. Les fragments sont fixés arbitrairement sur une surface par hybridation des adaptateurs. Les extrémités libres des fragments immobilisés s’hybrident à une amorce complémentaire (amplification par ponts) et sont copiés par la polymérase. Ce processus d’amplification est ensuite répété, aboutissant à la formation de clusters de brins d’ADN. Plusieurs millions ( à ) de clusters sont ainsi amplifiés simultanément sur la surface. En fin d’amplification, chaque cluster contient jusqu’à molécules identiques. Cette haute densité de brins d’ADN facilite et augmente le débit de séquençage. Le séquençage des fragments amplifiés se fait via un procédé de séquençage par synthèse qui incorpore les quatre nucléotides, marqués par des fluorochromes différents, au sein de brins d’ADN immobilisés. A chaque cycle de séquençage, les quatre terminateurs réversibles ainsi que des amorces et la polymérase sont ajoutés sur la plaque de verre. Les terminateurs réversibles sont alors incorporés dans les brins d’ADN. Après l’excitation laser, l’image de la fluorescence émise par chaque cluster est capturée par lecture optique. Chaque cycle se termine par le clivage du terminateur et la restauration du groupement fonctionnel du nucléotide incorporé, ce qui permet à l’ADN polymérase d’incorporer le prochain nucléotide lors du cycle suivant. Les cycles sont ainsi répétés pour déterminer la séquence de chacun des fragments, base par base. Cette technique reposant sur la chimie des terminateurs, les insertions et les délétions sont rares. Les substitutions sont le type d’erreurs le plus courant pour cette technologie. La très haute densité de la puce (plus de millions de molécules par centimètre carré) permet de séquencer jusqu’à plusieurs dizaines de millions de lectures.