Analyse bactériologique des échantillons

Dans cette étude, nous avons recherché les bactéries indicatrices de pollution (Coliformes, Streptocoques et anaérobies sulfito-réducteurs), et les bactéries pathogènes strictes ou pathogènes opportunistes. Pour la recherche des bactéries indicatrices de pollution, nous avons procédé à un dénombrement en utilisant une méthode simple, qui est la colimétrie. Celle-ci désigne « la technique de numération en tubes multiples » (TNTM) avec détermination du nombre de germes le plus probable (NPP) à partir de la table de Mac Grady extraite de la norme NF T90- 413, préconisée par l’unité de coordination de PAM (Plan d’Action pour la Méditerranée) (Anonyme 1987). C’est l’examen le plus important et le plus pratiqué dans les analyses de l’eau ou de fruits de mer, répondant à des préoccupations sanitaires (Rodier, 1978). Pour la mise en évidence des bactéries anaérobies sulfito- réductrices, considérées aussi comme des témoins de pollution fécale, nous avons utilisé, la recherche et le dénombrement par incorporation en gélose. Quant à la recherche des bactéries pathogènes (Salmonelles, pseudomonas et staphylocoques), elle a été effectuée par ensemencement sur gélose spécifique. 

Prélèvement de l’eau 

Les prélèvements d’eau sont effectués mensuellement durant la période s’étalant de janvier à décembre 2008. Pour cela, nous utilisons des flacons en verre d’une capacité de 250 ml soumis au préalable a un nettoyage rigoureux (un rinçage a l’eau potable puis 3 rinçage à l’eau distillée) séchés, bouchés, enveloppés séparément dans un morceau de papier filtre (Rodier, 2005) puis stérilisés à l’autoclave à une température de 121° C pendant 15mn (O.M.S.1983). Les flacons stériles sont plongés à une profondeur d’environ 50 cm de la surface de l’eau puis ouverts à contre courant. Une fois remplis, ils sont refermés sous l’eau pour éviter la formation de bulles d’air et tout risque de contamination lors du transport. Une fois les prélèvements effectués, les flacons sont étiquetés et placés dans une glacière à l’abri de la lumière et à une température de 4°C car la teneur en germes des eaux risque de subir des modifications dans les flacons, après le prélèvement. L’évolution est d’ailleurs assez difficile à prévoir et dépend de nombreux facteurs ; température, concurrence bactérienne des espèces présentes, composition chimique de l’eau. C’est pour cela que toute analyse doit être effectuée le plus rapidement possible. La norme NF T 90-420 de février 1987 indique que les échantillons doivent être maintenus à une température comprise entre 1et 4°C dés leur prélèvement. Ils doivent être analysés le jour même, il est donc admis que le délai maximum entre le prélèvement et le début de l’analyse ne doit pas excéder 24 heures, aussi il est préférable de le raccourcir lorsque l’eau est présumée être très polluée (Rodier, 2005) En ce qui concerne, la surveillance des eaux côtières, l’analyse au laboratoire débute dans un délai maximum de 8 heures après le prélèvement de l’échantillon selon les recommandations de Rodier (1984). Tout prélèvement doit être accompagné d’une fiche de renseignement sur laquelle on note : o Lieu de prélèvement. o Date et heure de prélèvement. o L’état de la mer. o Le vent (la direction). 3.2. Récolte des bivalves et préparation des échantillons : L’espèce Perna perna est retrouvée au niveau des zones rocheuses des sites précités. La récolte s’effectue manuellement et de façon aléatoire. Les bivalves récoltés sont au nombre de 4 à 7 selon la taille; ils sont placés dans des sacs de congélations propres et étiquetés, sur lesquels on note la date, le site et l’espèce. Ensuite, ils sont entreposés dans des glacières à une température comprise entre 4°C à 10°C (A.C.I.A, 2004) pour être acheminés au laboratoire. Une fois au laboratoire, les moules sont débarrassées des byssus et des épizoaires présents sur leurs coquilles, puis brossées sous l’eau du robinet et enfin désinfectées superficiellement par un jet d’alcool et flambage rapide. Après ouverture aseptique, le contenu entier : chair et liquide inter-valvaire est recueilli stérilement, puis dilué, et soumis au broyage par un broyeur homogénéiseur, Ultra-Turrax, préalablement nettoyé (15 000 t/mn pendant 30 secondes), afin d’obtenir un broyat homogene considéré comme la dilution mère de l’échantillon à tester (OMS, 1983). L’analyse porte donc sur la chair et le liquide inter-valvaire (Guiraud, 2003).

Analyse bactériologique de l’eau

Préparation des dilutions décimales

Conformément aux normes AFNOR NF VO8-010 et ISO 6887-1, on effectue des dilutions décimales pour chaque échantillon à l’aide d’eau distillée stérile; ou tampon phosphate. Elles doivent être effectuées dans des conditions aseptiques et minutieuses. Les dilutions suivent des séries logarithmiques dont les termes sont en progression géométriques : 0.1 ; 0.01 ; 0.001 ;…etc. *Les dilutions : o Dilution 10° : consiste à la prise directe de la solution mère. o Dilution 10-l : dans un tube à essai contenant 9ml d’eau distillée stérile, on ajoute 1ml d’eau à analyser (10°). o Dilution I0-2 : Dans un deuxième tube à essai, on ajoute 1ml de la dilution 10- l à 9ml d’eau distillée stérile (fig.9). NB : L’agitation du contenu est nécessaire avant de préparer chaque dilution. Dilution 10 ° Dilution 10ˉ¹ Dilution 10ˉ² 1 ml 1 ml 100 ml 9 ml d’eau 9 ml d’eau Eau à analyser distillée distillée stérile stérile Figure 9 : Préparation des dilutions

 Recherche et dénombrement des Coliformes totaux et recherche d’Escherichia coli 

*Principe : Conformément à la norme NF T90- 413, il consiste à utiliser des milieux liquides de bouillon lactose bilié au vert brillant (BLBVB), dans des tubes munis de cloches de Durham. La présence des germes recherchés se traduit par : o Un virage de couleur dans toute la masse liquide. o Un dégagement de gaz dans les cloches. *Mode opératoire : La colimétrie comporte deux tests: – Un test présomptif. – Un test confirmatif. Le dénombrement est effectué suivant la méthode du nombre le plus probable (NPP) de la table de Mac Grady (Annexe). *Test présomptif: Recherche et dénombrement des coliformes totaux: On prépare 3 séries de 3 tubes chacun contenant 9 ml de bouillon lactose bilié au vert brillant (BLBVB)simple concentration, munis de cloches de Durham. Chacun des 3 tubes de la première série reçoit 1 ml de la dilution 10° (solution mère).Les tubes de la deuxième et troisième série reçoivent respectivement 1 ml de la dilution 10- l et 1 ml de la dilution 10- 2 . Nous agitons pour homogénéiser, sans faire pénétrer l’air dans la cloche de Durham. L’ensemble des tubes ainsi préparés est incubé à 37° C pendant 24 à 48 h (fig.10). Remarque : Cette phase de la colimétrie se base sur la propriété commune des Coliformes à fermenter le lactose tout en produisant du gaz ; elle ne permet que de présumer de la présence des coliformes dans l’eau à analyser. De ce fait, l’application du test confirmatif s’impose.