Biodiversité et maladies infectieuses

 LES LEISHMANIOSES : ASPECTS CLINIQUES ET BIOLOGIQUES 

GÉNÉRALITÉS

 Les leishmanioses sont un ensemble de maladies causées par des parasites du genre Leishmania Ross, 1903. Les Leishmania sont des protozoaires flagellés de la famille des Trypanosomatidae (Kinetoplastida), transmis par la piqûre de petits diptères hématophages, les phlébotomes (Psychodidae, Phlebotominae). La plupart des leishmanioses affectant l’homme sont zoonotiques, leur cycle de transmission impliquant des hôtes réservoirs mammifères domestiques et sauvages. Ces maladies se manifestent par différentes formes cliniques chez l’homme, dépendant en grande partie de l’espèce de Leishmania en cause: leishmaniose viscérale (LV), la leishmaniose cutanée localisée (LCL) ou cutanée diffuse (LCD) et la leishmaniose cutanéomuqueuse (LCM). L’homme est confronté aux leishmanioses depuis des temps anciens, comme l’indique l’existence de descriptions de lésions évoquant fortement la leishmaniose cutanée datant d’environ 2500 ans av. J.-C., et la découverte d’ADN leishmanien chez des momies de l’Egypte antique (Zink et al. 2006; Akhoundi et al. 2016). Les premières descriptions cliniques détaillées de la leishmaniose viscérale datent quand à elles du 18ème siècle en Inde, mais le parasite ne fut formellement identifié qu’au début du 20ème siècle. Aujourd’hui, les leishmanioses sont largement réparties dans le monde, principalement en zone intertropicale, mais débordant en zone tempérée (Figure 14). Elles sont endémiques dans 98 pays appartenant à quatre continents. On estime qu’elles sont responsables de plus d’un million de cas chaque année, et de 20,000 à 40,000 décès (Alvar et al. 2012). Touchant essentiellement les populations les plus pauvres, elles sont classées par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme maladies tropicales négligées

 CYCLE PARASITAIRE, PHYSIOPATHOLOGIE ET FORMES CLINIQUES 

D’après Dedet (2009). Les Leishmania, présentes sous forme amastigote dans la peau ou le sang d’un mammifère infecté, sont ingérées par un phlébotome à l’occasion d’un repas sanguin (Figure 15). Dans le tube digestif du vecteur, ces parasites se transforment rapidement en promastigotes puis traversent la membrane péritrophique. Après une phase de multiplication Introduction générale 40 dans la lumière de l’intestin, ils migrent vers la partie antérieure du tube digestif où ils deviennent infestant (les promastigotes métacycliques), qui seront injectés chez un nouvel hôte mammifère lors d’une piqûre ultérieure. Figure 14: Niveau de consensus pour la présence des leishmanioses cutanées (A et B) et viscérales (C et D) dans le Nouveau (A et C) et l’Ancien Monde (B et D), basé sur la confrontation de sources de données variées. Les points bleus indiquent des points ou des centroïdes d’occurrence (Pigott et al. 2014). Dans le derme, l’installation des parasites est favorisée par des molécules contenues dans la salive du phlébotome ayant une action immunosuppressive locale (Kamhawi 2000). Les promastigotes métacycliques sont phagocytés par des macrophages du derme, et intègrent une vacuole parasitophore dans laquelle ils repassent en forme amastigote. Les parasites résistent à la digestion par les macrophages grâce à différents mécanismes de sabotage moléculaire (Arango Duque & Descoteaux 2015). Après leur multiplication et l’éclatement du macrophage, les Leishmania peuvent infecter de nouvelles cellules phagocytaires localement, ou migrer vers d’autres tissus, en fonction du tropisme de l’espèce en cause et les caractéristiques de l’hôte. Les défenses immunitaires permettent généralement de limiter le       Les leishmanioses 41 développement du parasite, donnant lieu en général à une infection asymptomatique (Costa et al. 2002; Bañuls et al. 2011). Dans de plus rares cas, l’infection se manifeste cliniquement. Figure 15: (A) Cycle de vie des Leishmania: (1) La femelle de phlébotome prend un repas sanguin sur un hôte infecté, (2,3) elle ingère des macrophages infectés par des formes amastigotes qui sont libérées après explosion de la cellule, (4) les amastigotes se transforment en promastigotes procycliques, (5) multiplication dans la lumière de l’intestin du phlébotome, (6) migration vers la partie antérieure du tube digestif (valve stomodéale) et nouvelle phase de multiplication, (7) les promastigotes se transforment en promastigotes métacycliques (formes infestantes), (8,9) le phlébotome injecte les promastigotes métacycliques chez un nouvel hôte par régurgitation lors d’un nouveau repas sanguin, (10) les promastigotes métacycliques infectent des macrophages, (11) transformation en forme amastigote, (12) les amastigotes s’attachent à la paroi des vacuoles parasitophores, (13,14) multiplication des amastigotes dans la vacuole, (15) les amastigotes sont libérés après explosion cellulaire, (16,17) les amastigotes libérés peuvent infecter de nouveaux macrophages. (B) Organisation structurale du promastigote. (C) Organisation structurale des amastigotes (extrait de Teixeira et al. 2013). La plupart des espèces de Leishmania ont un tropisme cutané exclusif. La leishmaniose cutanée localisée est la forme la plus commune et résulte de la multiplication du parasite au site d’inoculation (y compris pour les Leishmania viscérotropes). Après une phase Introduction générale 42 d’incubation allant d’un à quatre mois, une lésion apparaît consistant d’abord en une petite papule inflammatoire. Celle-ci grossit ensuite de manière constante, et évolue le plus souvent vers une forme ulcérée dite « humide », nettement circonscrite par un bourrelet périphérique et pouvant s’élargir jusqu’à une dizaine de centimètres. D’autres formes « sèches » ou tuberculoïdes peuvent également être observées. Ces lésions ne sont théoriquement pas douloureuses sauf en cas de surinfection et finissent par guérir spontanément, mais ceci peut prendre plusieurs mois, voire plusieurs années, et laissent des cicatrices indélébiles pouvant être particulièrement invalidantes lorsqu’elles se trouvent au niveau du visage. Le plus souvent chez des sujets anergiques ou atteints de déficience immunitaire, il peut être observé des formes cutanées diffuses. Celles-ci sont généralement causées par Leishmania aethiopica dans l’ancien monde et par L. amazonensis dans le nouveau monde. Ces formes sont caractérisées par l’apparition de nodules un peu partout sur le corps, qui grossissent jusqu’à se rejoindre pour former de larges plaques, évoquant des lésions lépreuses. La leishmaniose cutanée est causée par une quinzaine d’espèces de Leishmania différentes depuis l’Amérique du Sud jusqu’en Asie centrale (Figure 14). Chez les sujets sensibles, les deux espèces de Leishmania viscérotropes (L. donovani et L. infatum) disséminent à tous les organes du système des phagocytes mononucléés, causant une leishmaniose viscérale. Après une période d’incubation de trois à six mois, la phase d’état évolue de manière chronique, avec aggravation progressive des symptômes : fièvre intermittente, anémie, amaigrissement et hyperplasie des organes atteints: rate, foie et éventuellement ganglions lymphatiques. Plus tard, des complications digestives, pulmonaires et hémorragiques peuvent survenir. L’anémie est l’un des signes les plus caractéristiques : en Inde, la maladie porte le nom de kala-azar (peste noire), en référence à l’aspect gris terreux que prend la peau des patients. A un stade avancé, la splénomégalie associée à un fort amaigrissement peut également être frappante (Figure 16). Sans traitement, la maladie évolue quasi-systématiquement vers la mort. Si un traitement est mis en place suffisamment tôt, le pronostic est favorable, mais les parasites ne sont pas forcément tous éliminés. Certains peuvent se maintenir dans l’organisme ou donner lieu à une complication dermique particulière, particulièrement pour l’espèce L. donovani : la leishmaniose cutanée post-kalaazar. La leishmaniose viscérale connait une distribution géographique très large, mais 90% des cas sont concentrés dans 6 pays selon l’OMS (Alvar et al. 2012): Inde, Bangladesh, Soudan, Soudan du Sud, Ethiopie et Brésil. Les leishmanioses 43 Figure 16: Sujets atteints de (A) leishmaniose viscérale, (B) leishmaniose cutanée post-kala-azar, (C) leishmaniose cutanée localisée et (D) leishmaniose cutanéo-muqueuse (source= OMS). Enfin, certaines espèces et en particulier L. braziliensis mais aussi l’espèce L. guyanensis sont responsables d’une forme clinique distincte : la leishmaniose cuntanéomuqueuse. Cette forme évolue en deux temps : l’atteinte initiale se manifeste comme une LCL classique, mais peut être suivie par une atteinte muqueuse, parfois plusieurs années après la guérison de la première lésion. Celle-ci commence généralement au niveau de la muqueuse nasale, et peut évoluer vers une destruction de la cloison nasale et une atteinte sévère de la muqueuse buccale, du palais et du pharynx. L’atteinte muqueuse peut progresser jusqu’à la mise en communication les fosses nasales et la cavité buccale, et conduire à de la dysphagie ou de la dysphonie. Les lésions des stades avancés sont particulièrement mutilantes et peuvent avoir un impact physiologique et psychosociologique sévère sur le sujet. L. braziliensis n’est présent que dans le nouveau monde, du sud du Mexique au nord de l’Argentine. Introduction générale 44 Il faut noter cependant que, même si l’on observe globalement une association entre espèces de Leishmania et formes cliniques chez l’homme, chaque espèce pathogène pour l’homme peut provoquer une grande diversité de symptômes, ce qui rend le diagnostic spécifique difficile (Bañuls et al. 2011). 

 PRÉVENTION, DIAGNOSTIC ET TRAITEMENT

 D’après Dedet (2009) et Buffet et al. (2011) Bien que des vaccins procurant une protection partielle pour le chien aient été mis sur le marché au Brésil et en Europe (Leish-Tec®, Hertape; Leishmune®, Fort Dodge; Canileish®, Virbac; Gradoni 2015), et que plusieurs candidats soient en cours de développement pour l’homme (Gillespie et al. 2016), aucun n’est encore disponible. La prévention des leishmanioses repose donc sur l’évitement des piqûres de phlébotomes, par l’emploi d’insecticides ou de répulsifs et de moustiquaires imprégnées. L’établissement d’un programme de lutte globale est compliqué du fait de la diversité de structure des foyers d’infection (voir partie 5.A). Le diagnostic de la maladie se fait par la recherche du parasite, de son ADN, ou par la mise en évidence immunologique de l’infection. Pour les méthodes parasitologiques directes, le prélèvement se fait par curetage ou biopsie de la lésion pour la LC ou la LCM, et principalement par ponction de moelle osseuse ou prélèvement de sang pour la LV. La mise en évidence du parasite peut se faire sur frottis coloré ou par mise en culture du prélèvement. Cette dernière méthode, bien que plus fastidieuse, dispose d’une meilleure sensibilité et permet de conserver la souche pour des études ultérieures. Le diagnostic moléculaire, par PCR en particulier, s’est beaucoup développé du fait des multiples avantages qu’il présente: grande sensibilité et spécificité, rapidité, et possibilité d’accéder à l’identification de l’espèce de Leishmania en cause (Marques et al. 2006; Ruiter et al. 2014). Il nécessite par contre des infrastructures, du matériel et du personnel spécialisé qui ne sont pas toujours disponibles dans les régions endémiques. Des alternatives reposant sur des techniques d’amplification isothermales, plus facilement applicables sur le terrain, ont été développées (Saldarriaga et al. 2016; Nzelu et al. 2016). Des tests immunologiques sont également employés. La LV et la LCD entrainent généralement la production d’anticorps circulants qui peuvent être détectés par immunofluorescence indirecte (IFI), méthode immuno-enzymatique (ELISA) ou agglutination directe (DAT) par exemple. Ces techniques présentent l’avantage d’être non-invasives et relativement faciles à mettre en œuvre (des kits commerciaux existent). Elles sont utiles en  Les leishmanioses 45 première intention mais souffrent d’un manque de spécificité du fait de possibles réactions croisées. De plus, la présence d’anticorps peut être associée à une infection asymptomatique ou passée, et n’indique pas nécessairement l’établissement de la maladie au moment du test. La LCL et la LCM s’accompagnent plutôt d’une réaction immunitaire de type cellulaire pouvant être mise en évidence par un test d’hypersensibilité retardée (test Montenegro), qui constitue en l’observation d’une réaction cutanée suite à l’injection intradermique d’antigènes parasitaires. Ce test a été mis au point il y a près d’un siècle au Brésil (Montenegro 1926) et représente encore l’outil diagnostique principal dans certaines régions (Antonio et al. 2014). Il bénéficie d’un bon niveau de sensibilité et de spécificité, et il est facile d’utilisation. Cependant, son résultat n’est pas immédiat et sa positivité persiste longtemps après la guérison. Le traitement des leishmanioses est compliqué par le coût et la toxicité des produits disponibles, la sensibilité variable des différentes espèces de Leishmania selon les molécules utilisées et l’existence de résistances chez certaines souches (Buffet et al. 2011). Les médicaments anti-leishmaniens classiques comprennent: • les sels pentavalents d’antimoine (Glucantime® et Pentostam®) qui agissent par inhibition de la synthèse d’adénosine triphosphate (ATP) • l’amphotéricine B (et ses formulations lipidiques, Fungizone®, AmBisome®), un antifongique puissant de la famille des polyènes, qui provoque une altération de la membrane cellulaire des parasites • la pentamidine (Pentacarinat®), une diamine aromatique agissant par inhibition de la synthèse d’ADN. L’utilisation de ces molécules est limitée par des effets secondaires importants et des voies d’administration et des posologies contraignantes (e.g. voie intraveineuse lente pendant plusieurs jours pour l’amphotéricine B). Les dérivés d’antimoine ont longtemps été les plus utilisés et restent encore aujourd’hui employés en première intention dans certains cas de LC (Buffet et al. 2011; Tableau 2). L’apparition de souches résistantes aux dérivés de l’antimoine, l’épidémie de co-infection Leishmania-VIH, et la meilleure tolérance des formulations lipidiques de l’amphotéricine B font que ces dernières sont de plus en plus utilisées dans le monde entier, et constituent d’ores et déjà le traitement de première intention pour la LV (Alvar et al. 2008; Boer et al. 2009). La pentamidine n’est efficace qu’à forte dose dans le traitement de la LV, pour lequel elle n’est plus préconisée, mais son usage reste recommandé dans certaines formes de LC. Plus récemment, un anti-leishmanien oral et bien toléré, la miltéfosine (Impavido®), a été employé avec succès pour le traitement de la LV en Introduction générale 46 Inde. Toutefois, de récents cas d’échecs ont été rapportés, et son efficacité semble plus variable dans d’autres zones géographiques ou pour le traitement de la LC (Monge-Maillo & López-Vélez 2015). D’autres molécules ont été proposées et font l’objet d’essais thérapeutiques, mais ne sont pas encore utilisées en pratique courante. Tableau 2: Synthèse du référentiel proposé pour la prise en charge des principales formes de Leishmanioses rencontrées en France (Buffet et al. 2011). Forme clinique/Espèce de Leishmania Traitement recommandé LV Amphotéricine B LC à L. major 1. Abstention si lésion peu gênante et patient consentant 2. Antimoniate de méglumine intralésionnel + cryothérapie 3. Si plus de 4 lésions, ou localisation des lésions incompatible avec traitement local, ou échec de traitement 2, amphotéricine B LC à L. tropica ou L. infantum 1. Antimoniate de méglumine intralésionnel + cryothérapie 2. Si plus de 4 lésions, ou localisation des lésions incompatible avec traitement local, ou échec de traitement 2, amphotéricine B LC à L. guyanensis ou L. panamensis 1. Iséthionate de pentamidine par voie intramusculaire 2. Si deux échecs du traitement 2, antimoniate de méglumine par voie intraveineuse lente ou IM, ou miltéfosine LC à L. braziliensis 1. Antimoniate de méglumine par voie IV lente ou IM 2. Si deux échecs du traitement 2, amphotéricine B ou miltéfosine LM à L. braziliensis 1. Antimoniate de méglumine par voie IV lente ou IM + pentoxyfilline 2. Si échec du traitement 2, amphotéricine B et/ou miltéfosine Les Leishmania 

 LES LEISHMANIA D’après Bañuls et al. (2007), Cantacessi et al. (2015) et Akhoundi et al. 2016) 

. ASPECTS MORPHOLOGIQUES ET GÉNOMIQUES 

Les Leishmania sont, comme tous les kinétoplastidés, caractérisés par une mitochondrie unique comprenant un génome exceptionnellement large et condensé, visible en microscopie par les techniques de coloration classiques : le kinétoplaste. La morphologie globale des Leishmania varie ensuite selon le stade parasitaire. Le stade promastigote chez le vecteur, est une forme extracellulaire mobile caractérisée par une forme allongée, une taille variant entre 10 et 25 µm, la présence d’un flagelle libre en position antérieure et une position du kinétoplaste à la base du flagelle (Figure 17). Le stade amastigote, chez l’hôte vertébré, est une forme intracellulaire immobile caractérisée par une forme ovoïde, un diamètre de 2 à 6 µm, un flagelle de courte taille inclus dans un repli cellulaire et un kinétoplaste en position juxtanucléaire. Les parasites se multiplient par divisions binaires simples au cours des deux stades. Figure 17: (A) Formes promastigotes de Leishmania sp. en microscopie après coloration classique (source: CDC). (B) Formes amastigotes de Leishmania sp. dans un macrophage infecté. Le noyau (flèche noire) et le kinétoplaste (flèche rouge) sont distinguables (source: CDC). (C) Formes promastigotes de L. infantum en microscopie à contraste interférentiel après marquage fluorescent de l’ADN (nucléaire et kinétoplastique) au DAPI (cliché : Baptiste Vergnes). (D) Amastigotes intracellulaires de L. infantum après marquage fluorescent de l’ADN au DAPI montrant le noyau du macrophage et l’ADN (nucléaire et kinétoplastique) des parasites (cliché : Baptiste Vergnes). Le génome leishmanien est constitué du génome nucléaire et du génome kinétoplastique. Plus de dix ans après le lancement du Leishmania Genome Network, le premier génome nucléaire de Leishmania séquencé fut celui de L. major (Ivens et al. 2005), Introduction générale 48 suivi rapidement par celui de L. braziliensis et de L. infantum (Peacock et al. 2007). Le développement des technologies de séquençage haut-débit a ensuite permis la production de génomes de référence pour L. mexicana (Rogers et al. 2011), L. donovani (Downing et al. 2011), L. amazonensis (Real et al. 2013), L. panamensis (Llanes et al. 2015), tandis que d’autres sont en cours. Le génome leishmanien a une taille variant entre 29 et 33 Mb selon les espèces, et est constitué de 34 à 35 chromosomes. Bien qu’ils soient classiquement considérés comme des organismes diploïdes, une grande plasticité génomique est observée chez les Leishmania. Chaque chromosome peut être monosémique, disomique ou trisomique selon la cellule considérée au sein d’une même souche (Sterkers et al. 2012). Cette « aneuploïdie mosaïque » constitue probablement une stratégie d’adaptation puissante pour le parasite. Le génome leishmanien est également caractérisé par des taux de GC et de séquence codante élevés, la répétition de gènes codants en tandem, la présence de longs groupes polycistroniques et la quasi-absence d’introns (Uliana et al. 2008). La régulation de l’expression génique ne se fait pas au niveau de la transcription chez les Leishmania, mais semble reposer sur la plasticité du nombre de chromosomes et de copies de gènes, ainsi que sur des mécanismes de maturation et de dégradation des ARN messagers. L’ADN kinétoplastique constitue le génome de l’unique mitochondrie des kinétoplastidés et représente 10 à 20% de l’ADN total de la cellule (Simpson 1987). Il s’agit d’un réseau de molécules circulaires concaténées de deux types: les maxicercles et les minicercles (Figure 18). Les maxicercles sont des molécules d’environ 20 kb présentes en quelques dizaines de copies homogènes et contiennent, comme chez d’autres eucaryotes supérieurs, les gènes des ARN ribosomaux de la mitochondrie et des sous-unités protéiques de la chaine respiratoire. Les minicercles sont de courtes molécules d’environ 1 kb présentes en des dizaines de milliers de copies. Ils codent pour des ARN guides intervenant dans le mécanisme d’édition des ARN messagers du maxicercle. Celui-ci consiste en la délétion ou l’insertion d’uridine au niveau de sites internes des ARN messagers pré-édités (Read et al. 2015) et est nécessaire à leur traduction en protéines. Différentes « classes » de minicercles coexistent dans le génome, ciblant des sites d’édition distincts.