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Découverte et historique de l’ART
Lors du début de la guerre du Vietnam en 1955, l’armée nord-vietnamienne recensa un nombre inquiétant de soldats infectés par le paludisme. En effet, l’élaboration de réseaux souterrains favorisa le cumul de l’eau de pluie, offrant aux anophèles un lieu propice à la reproduction. De cela fut né, le 23 mai 1967, le projet secret « 523 » avec pour objectif premier de découvrir une solution efficace contre le paludisme à partir de la médecine traditionnelle chinoise57. Près de 500 chercheurs répartis à travers 60 instituts scientifiques ou militaires participèrent à son accomplissement suite aux ordres promulgués par leur chef militaire, Mao Zedong. Diverses équipes ont été constituées : une partie s’est concentrée sur le développement de combinaisons thérapeutiques supplémentaires ; d’autres scientifiques passèrent au crible quelques dizaines de milliers de molécules connues ; tandis qu’un dernier groupe s’attela à la littérature chinoise et entreprit plusieurs expéditions pour recueillir diverses herbes ou plantes, certaines utilisées dans des villages reculés d’Asie pour traiter la fièvre. Une équipe dirigée par Tu Youyou (Figure 7A) – récompensée en 2015 par le prix Nobel de physiologie et de médecine pour l’ensemble de ses travaux liés au paludisme – découvrit, peu de temps après le lancement du projet le « qinghao », une décoction utilisée dès les premiers signes de la maladie dans un village pourtant peu touché par ce trouble. Rapidement, le groupe détermina la plante associée à ce traitement, identifiée comme une armoise annuelle : Artemisia annua58 (Figure 7B).
Les principes actifs furent isolés entre 1972 et 1973, parmi lesquels figure l’ART (Figure 7C), dont l’activité antipaludique a été investiguée par le pharmacologue et médecin Li Shizhen58. Les premiers essais en laboratoire furent spectaculaires et démontrèrent des résultats encourageants dans l’élimination rapide des parasites liés au paludisme57.
Malgré la fin de la guerre du Vietnam en 1976 et l’avortement définitif du projet « 563 » en 1981, les travaux cliniques sur l’ART ont continué, la molécule représentant une aubaine pour les régions d’endémie palustre58,59. La structure de l’ART, obtenue par diffraction aux rayons X, révèle la présence d’un pont endopéroxyde, lequel lie de façon covalente deux atomes d’oxygène sur l’un des trois cycles de la molécule. Ces connaissances permirent de concevoir les ARTDs semi-synthétiques tels que l’artésunate et l’artéméther en 1987, et la DHA en 1992 (Figure 7C)60. Pourtant, bien que les propriétés indéniables de l’ART dans la lutte contre le paludisme soient ouvertement reconnues depuis le début des années 1970, l’OMS n’inclut les ARTDs et les CTAs qu’au début des années 2000 comme traitements essentiels. Fin 2014, 81 pays ont adopté les CTAs comme traitements de première intention contre les accès palustres simples24,50.
Figure 7 : L’ART, extraite d’une armoise annuelle, Artemisia annua¸ découverte par Tu Youyou. (A) Portrait de Tu Youyou, principale investigatrice dans la recherche sur Artemisia annua. Elle est récompensée en 2015 par le prix Nobel de physiologie et de médecine pour l’ensemble de ses travaux liés au paludisme. (B) Gravure de Artemisia annua (Kops et al. 1906). (C) Structures moléculaires de l’ART et de ses principaux dérivés semi-synthétiques (ARTDs).
Mode d’action des ARTDs
L’ART et l’ensemble de ses dérivés sont des lactones sesquiterpéniques61 avec une activité puissante contre la majorité des stades sanguins des parasites du genre Plasmodium62,63, mais de courte durée du fait de leur demi-vie d’élimination plasmatique chez le patient comprise entre 1 et 2 heures. Notamment, les ARTDs ont un impact sur tous les stades érythrocytaires asexués (rings, trophozoïtes, schizontes) – lesquels provoquent les manifestations cliniques de la maladie – et les gamétocytes immatures. Cependant, les parasites au stade ring sont rapportés comme moins sensibles à l’ART, par comparaison avec les autres stades asexués64. En outre, les différents stades sont sensibles aux ARTDs en raison de la digestion active de l’hémoglobine à mesure de leur développement dans les GRs. Il est aujourd’hui admis que le clivage du pont endopéroxyde de l’antipaludique par l’ion Fe2+ associé à l’hème est nécessaire à l’activation des ARTDs61. Ce clivage engendre la formation de dérivés réactifs qui ciblent les groupements nucléophiliquesi des protéines et des lipides du parasite. Les récents travaux de Wang et al. (2015) ont démontré qu’environ 120 protéines du parasite se lient de façon covalente avec l’ART, la majorité d’entre elles étant impliquées dans des processus biologiques essentiels à la survie du parasite65,66. Notamment, ces protéines auraient des rôles dans les processus de dégradation de l’hémoglobine, de la défense anti-oxydante, de la synthèse des protéines, et de la dégradation de protéines par le protéasome67,68.
Chez les patients infectés, l’élimination des parasites par les ARTDs ne peut être étudié que dans le sang périphérique, où les rings se développent et circulent au sein des GRs pour une durée comprise entre 12 et 16 heures avant de former les jeunes trophozoïtes séquestrés dans les microvaisseaux62,69. Lorsque les rings sont exposés aux ARTDs, ils se condensent en formes pycnotiques (dégradation du noyau des cellules du parasitei), puis sont éliminées efficacement du flux sanguin sans destruction des GRs de l’hôte70. Quant aux formes séquestrées (trophozoïtes, schizontes et gamétocytes immatures), elles sont éliminées in situ dans les microvaisseaux après exposition aux ARTDs. Il est estimé que les ARTDs réduisent par un facteur 104 la densité parasitaire au cours des premières 48 heures suivant l’initiation du traitement, détruisant rapidement les rings avant qu’ils ne puissent se transformer en trophozoïtes matures et schizontes. Cette propriété pharmacologique est une spécificité remarquable des ARTDs car trophozoïtes matures et schizontes sont des formes intra-érythrocytaires particulièrement virulentes du fait qu’elles séquestrent dans la microvasculature et induisent des symptômes cliniques69.
De la monothérapie d’ART aux CTAs
Au début des années 1990, nombreuses sont les études à démontrer une aggravation des phénomènes de résistance des parasites à différents antipaludiques utilisés en monothérapie (comme la CQ et l’association sulfadoxine-pyriméthamine qui est considérée comme une monothérapie par l’OMS)54. Dans la mesure où la clairance des ARTDs dans le sang est extrêmement rapide et nécessite un nombre élevé de prises pouvant favoriser l’émergence de parasites résistants à ces molécules, l’OMS a recommandé en 2006 l’arrêt de leur utilisation en monothérapie au profit des bithérapies de type CTAs24. Cinq CTAs sont actuellement utilisées : artésunate-sulfadoxine-pyriméthamine (ASSP), artéméther-luméfantrine (AL), dihydroartémisinine-pipéraquine (DP), artésunate-amodiaquine (ASAQ) et artésunate-méfloquine (ASMQ)24,39. Une sixième bithérapie est en train d’être déployée, artésunate-pyronaridine (ASPY)71, alors que ASSP est presque abandonnée. Le mode d’action des différentes molécules partenaires aux ARTDs et une brève description de leur utilisation en bithérapie sont présentés dans l’encadré 3. Le principe sous-jacent des CTAs est que l’ARTD élimine la majorité des parasites en quelques heures après chaque dose quotidienne du traitement de 3 jours (contre 7 en monothérapie), tandis que la molécule antipaludique partenaire tue les parasites résiduels sur plusieurs jours – en raison d’une activité nettement plus longue que les ARTDs – via un autre mécanisme d’action72,73. Cette multiplicité et complémentarité des modes d’action visent à éliminer complètement les parasites chez le patient et aussi limiter l’apparition de résistance. Par exemple, l’action rapide des ARTDs, par un simple effet de diminution rapide de la biomasse parasitaire, réduit considérablement le risque que les parasites restants développent une mutation conférant la résistance à la molécule partenaire. Inversement, la molécule partenaire protège l’apparition de résistance aux ARTDs. Pourtant, malgré les précautions prises par l’OMS, des phénomènes de résistance aux ARTDs ont été observés à la fin des 2000 en Asie du sud-est, plus récemment en Papouasie-Nouvelle Guinée56 et possiblement en Inde74–76, relançant la crainte d’une nouvelle propagation de résistance aux CTAs à l’ensemble des zones d’endémie palustre55.
Encadré 3 : Présentation des principales CTAs recommandées par l’OMS et mode d’action des molécules partenaires.
Artéméther-luméfantrine (AL) : Cette bithérapie est actuellement la plus largement utilisée dans les zones d’endémie palustre, représentant près de 75% des CTAs achetées (hors marché noir et trafic)24. Le mode d’action de la luméfantrine est encore mal compris, mais elle interfèrerait avec la détoxification de l’hème77 et/ou inhiberait directement la protéine P. falciparum multidrug resistance 1 (PfMDR1 ; transporteur impliquée dans de multiples résistances aux antipaludiques)78. Si certaines études montrent une légère diminution de l’efficacité de cette bithérapie, notamment en Angola ou encore en Gambie79, son utilisation n’est pour l’heure pas remise en cause. La diminution de la sensibilité à la luméfantrine serait associée à une variation du nombre de copies du gène pfmdr1 (hypothèse non confirmée par des méta-analyses80) et à la présence d’allèles sauvages des gènes pfmdr1 et pfcrt81.
Artésunate-amodiaquine (ASAQ) : Cette bithérapie représente près de 20% des ventes totales des CTAs et est utilisée à ce jour uniquement en Afrique subsaharienne. L’amodiaquine est également utilisée en association avec la sulfadoxine-pyriméthamine en tant que traitement prophylactique chez les jeunes enfants durant la saison des pluies dans la région du Sahel39. Le mode d’action de l’amodiaquine est similaire à celui de la CQ, c’est-à-dire que la molécule s’accumule dans la vacuole digestive du parasite à de fortes concentrations, empêche la détoxification de l’hème et conduit à la mort du parasite82. La résistance à l’amodiaquine est associée à des mutations non-synonymes des gènes pfcrt et pfmdr1, et plus spécifiquement celles conférant la résistance à la CQ83.
Dihydroartémisinine-PPQ (DP) : Utilisée par certains pays d’Asie du sud-est et depuis peu en Afrique, la combinaison DP est également prescrite comme traitement prophylactique pendant la grossesse84. Elle est d’ailleurs massivement utilisée dans les régions africaines proches d’une élimination totale du paludisme. Toutefois, l’utilisation de cette bithérapie est actuellement remise en question dans la sous-région du Grand-Mékong en raison de l’émergence de parasites résistants à la PPQ85. L’échec du traitement fut observé pour la première fois dans l’ouest du Cambodge, atteignant 24,1% d’échecs thérapeutiques en 201086. Le mode d’action de la PPQ n’est pas entièrement élucidé, mais pourrait être similaire à celui de la CQ, c’est-à-dire s’accumulant dans la vacuole digestive et inhibant la voie de dégradation de l’hémoglobine87. Récemment, la résistance à la PPQ a été associée avec une variation du nombre de copies des gènes plasmepsin II et III88, ainsi que des mutations localisées dans le gène pfcrt87,89. La résistance à la PPQ semble différente de celle à la CQ, malgré leur mode d’action similaire89. Artésunate-Méfloquine (ASMQ) : La combinaison ASMQ fut la première CTA à avoir été introduite en Asie du sud-est, limitant ainsi la propagation de la résistance à la méfloquine (jusqu’alors utilisée en monothérapie depuis les années 1990)90. La bithérapie est actuellement utilisée en Asie du sud-est. Son utilisation n’a cessé de décroître au fil des années et se limite dorénavant à quelques pays en raison d’une résistance déjà présente à la méfloquine24. Le mode d’action de la méfloquine n’est pas encore pleinement élucidé mais, tout comme la CQ et la PPQ, elle agirait par inhibition de la détoxification de l’hème77, de la fonction physiologique de pfmdr191, et/ou de la synthèse protéique via une interaction avec le ribosome cytoplasmique (pf80S)92. La résistance à la méfloquine est associée à une variation du nombre de copies du gène pfmdr193, et potentiellement à des mutations non-synonymes des gènes P. falciparum multidrug resistance protein 1 (pfmrp1) et 2 (pfmrp2)94,95.
Artésunate-Pyronaridine (ASPY) : Pas encore officiellement recommandée par l’OMS, cette bithérapie a toutefois reçue une opinion positive de la part de l’Agence européenne des médicaments et devrait par conséquent être introduite sous peu. L’association des deux molécules a montré un taux d’efficacité élevé en Afrique, à un niveau similaire aux combinaisons DP et AL96. Toutefois, l’efficacité a montré des limites dans la région ouest du Cambodge, probablement en raison de la résistance aux ARTDs et à une résistance croisée entre la pyronaridine et la PPQ97. Le mode d’action de la pyronaridine est peu caractérisé : elle interférerait avec la formation de l’hémozoïne98. Pour l’heure, la résistance à la pyronaridine n’a pas été clairement démontrée, mais des variations de la sensibilité à cette drogue pourrait être liées à des mutations non-synonymes du gène pfcrt99.
Émergence et caractérisation de la résistance aux ARTDs
La résistance aux ARTDs fut initialement rapportée en 2008 sur des parcelles de Battambang, province située à l’ouest du Cambodge100. En mesurant la durée de clairance parasitaire suite à un traitement à base d’artésunate en monothérapie chez 60 patients atteints de formes simples du paludisme, il a été observé que pour deux d’entre eux, le temps nécessaire pour éliminer les parasites était significativement allongé (Figure 8A). La présence de parasites résistants dans la province de Pailin au Cambodge – démontré en 2009 via un procédé similaire55 (Figure 8B) – confirma ces résultats initiaux. Depuis, les pays de la sous-région du Grand Mékong font l’objet d’incessantes investigations pour rapporter les cas de résistance : aujourd’hui, la résistance aux ARTDs s’est également propagée au Myanmar, au Vietnam, à la République démocratique populaire Lao – communément appelé Laos – et à la Chine50. Quelques cas de résistance ont été observés en Inde74,75, tandis qu’ils restent extrêmement rares en Afrique101. Cependant, cette émergence de résistance initiale en Asie du sud-est n’est pas sans rappeler les précédents scénarios d’émergence de résistance pour les premières générations d’antipaludiques comme la CQ ou la sulfadoxine-pyrimethamine, lesquels ont vu leurs résistances respectives apparaître en Asie du sud-est avant de se propager ou d’émerger de façon indépendante en Afrique plusieurs années plus tard54 (cf. section 1.1.6, Figure 6). En conséquence, il convient de mener des actions urgentes pour prévenir et lutter contre l’apparition de résistance, notamment dans les pays les plus vulnérables comme ceux de l’Afrique subsaharienne.
Figure 8 : Durée de clairance parasitaire pour des patients traités par monothérapie ou bithérapie à base d’ARTD. (A) Évolution des densités parasitaires 120 heures après la première prise d’artésunate chez un patient guéri (courbe verte) et deux patients présentant un échec au traitement du fait d’ une infection résistante à l’artésunate (courbes jaune et bleu). La figure a été reprise sans modifications du travail de Noedl et ses collaborateurs (2008)100. (B) Évolution des densités parasitaires médianes (normalisées en log10). Diverses modalités de traitement dans différentes zones d’endémie palustre ont été appliquées afin de mesurer la variation de la durée d’élimination des parasites. La clairance parasitaire est significativement allongée pour les patients vivant à Pailin, au Cambodge (courbes rouge et violette). La figure a été tirée sans modifications du travail de Dondorp et al. (2009)55.
Cliniquement, la résistance aux ARTDs se traduit par une réduction de la vitesse d’élimination des parasites chez le patient traité (mesurée par l’estimation de la demi-vie de clairance parasitaire) que ce soit en monothérapie ou en CTAs. Selon la définition de l’OMS, la résistance clinique aux ARTDs est avérée lorsque la demi-vie de clairance parasitaire est supérieure à 5 heures50. Cette méthodologie s’avère à la fois longue et coûteuse car basée sur le suivi clinique des patients avec notamment plusieurs prélèvements de sang dans les 24 premières heures après initiation du traitement. Ce suivi requiert d’importants moyens logistiques et la demi-vie de clairance parasitaire peut être biaisée par d’autres facteurs tels que l’observance et l’immunité partielle du patient102. Par la suite, une méthodologie in vitro / ex vivo développée en 2013 et nommée « Ring-stage Survival Assay » (RSA0-3h) a été proposée afin de détecter la résistance aux ARTDs103. Cette technique mesure le taux de parasites survivants suite à une courte exposition (6 heures) des stades précoces érythrocytaires (rings) à de hautes concentrations d’ARTD (exemple : 700 nM de DHA, classiquement observée dans le plasma des patients traités). On estime qu’un taux de survie des parasites supérieur à 1% correspond à un phénotype de résistance suite à des corrélations in vitro / in vivo103.
La découverte d’un déterminant moléculaire de la résistance aux ARTDs : le gène pfk13
Si la résistance aux ARTDs est aujourd’hui bien documentée en Asie du sud-est, elle n’est ni confirmée ni suspectée en Afrique, se limitant à une poignée de cas cliniques recensés50,101. Un marqueur moléculaire fiable pour la surveillance rapide à large échelle de la résistance a été découvert par plusieurs équipes françaises. Des analyses génomiques comparatives entre une lignée résistante aux ARTDs (F32-ART5 ; générée in vitro par pression de sélection médicamenteuse en ART) par rapport à la souche sauvage initiale (F32-TEM), ont permis d’identifier huit mutations non-synonymes sur sept gènes différents de la souche F32-ART5 (Figure 9A)104. Parmi ces mutations figure M476I sur le locus PF3D7_1343700, apparue après 30 cycles de pression de sélection médicamenteuse et associée à un RSA supérieur à 1%, suggérant son implication dans la résistance aux ARTDs. Après génotypage de 49 isolats parasitaires collectés entre 2010 et 2011 au Cambodge et adaptés en culture, plusieurs mutations non-synonymes situées sur le locus PF3D7_1343700 ont été répertoriées et associées à un RSA > 1% alors qu’elles sont absentes des isolats et souches de référence sensibles aux ARTDs (souches 3D7, 89F5 et K1992). Collectivement, ces résultats ont montré l’association de mutations de ce locus, dénommé par la suite P. falciparum k13 (pfk13), avec la résistance aux ARTDs (Figure 9B)104. Par la suite, des expériences de transfection sur pfk13 ont révélé que la seule présence de ces mutations peut conférer la résistance aux ARTDs105,106, permettant de considérer pfk13 comme un marqueur, mais aussi comme un déterminant moléculaire de la résistance.
Figure 9 : Mise en évidence de mutations non-synonymes dans le gène pfk13 comme marqueurs moléculaires de la résistance aux ARTDs. (A) Acquisition temporelle de mutations chez la souche F32-ART5, soumise à une pression de concentration croissante d’ART (échelle des ordonnées de gauche). Les loci mutés sont indiqués dans les encadrés rouges. Les cercles orange et vert indiquent le taux de survie RSA0-3h (échelle des ordonnées de droite) pour les souches soumises (F32-ART5) ou non (F32-TEM) à une pression de sélection médicamenteuse, respectivement. La mutation non-synonyme sur le locus PF3D7_1343700 (gène pfk13) est apparue après le 30ème cycle (symbole † sur la figure). (B) Taux de survie d’isolats parasitaires provenant du Cambodge et portant diverses mutations du gène pfk13. Un taux de survie RSA0-3h supérieur à 1% est systématiquement observé pour les mutants pfk13 par rapport aux isolats sauvages. Les figures ont été tirées du travail de Ariey et ses collaborateurs (2014)104.
Le gène pfk13 code la protéine PfK13 d’une longueur de 726 acides aminés et appartenant à la superfamille de protéines contenant un domaine en forme de propulseur ou hélice, communément appelé propeller (signifiant hélice en anglais) ou Kelch104,107,108. Cette protéine contient trois domaines annotés : un domaine coiled-coil (c’est-à-dire deux hélices α parallèles qui s’enroulent entre elles ; acides aminés 212 à 341), un domaine BTB (pour Broad-Complex, Tramtrack and Bric-à-brac; acides aminés 350 à 437) et un domaine propeller de type Kelch (acides aminés 443 à 726 ; Figure 10A). La structure cristallographique a été résolue pour les domaines BTB et propeller dans un état dimérique (Figure 10B), accessible avec les identifiants PDB 4yy8 et 4zgc (avec une résolution de 1,81 Å et 2,5 Å, respectivement ; ces deux structures diffèrent également par la présence d’un pont disulfure entre les résidus d’acides aminés C532 et C580)109,110. Le domaine propeller de PfK13 est composé de la répétition de six motifs kelch (aussi appelé blade) ; chaque motif kelch est long d’une cinquantaine d’acides aminés et forme un feuillet β impliquant quatre brins β antiparallèles107,108. Ce domaine, que nous appellerons KREP (Kelch-REpeat Propeller) dans la suite de ce manuscrit de thèse, concentre la grande majorité des mutations de résistance aux ARTDs associées à un taux de survie RSA0-3h supérieur à 1% et/ou à une clairance parasitaire retardée in vivo. Enfin, des expériences de mutagénèse ont suggéré le rôle essentiel du gène k13 pour la croissance intra-érythrocytaire de P. falciparum et P. berghei lors de la phase asexuée111,112.
Figure 10 : Présentation de la protéine PfK13. (A) Annotation des domaines composant PfK13. La protéine contient une région N-terminale variable parmi les Apicomplexa, et trois domaines annotés : un domaine coiled-coil, un domaine BTB et un domaine KREP. Ces deux derniers domaines sont généralement retrouvés dans des complexes d’ubiquitination, dans lesquels un substrat protéique est polyubiquitiné puis conduit en voie de dégradation. (B) Représentation dimérique des domaines BTB et KREP de PfK13. Les domaines BTB et KREP du premier monomère sont colorés en cyan et en bleu, respectivement ; le second monomère est représenté en gris. La structure est affichée du dessus (panel de gauche) et de côté (panel de droite).
En étudiant les séquences de pfk13 obtenues à partir de 1 876 patients ayant contracté un paludisme non compliqué au cours de la période 2001-2014 le long de la frontière Myanmar-Thaïlande, Anderson et al. (2017) ont montré que la mutation E252Q (localisée sur le domaine coiled-coil de PfK13) prédominait initialement dans cette région et était associée à un retard de clairance légèrement allongé113. Au cours de ces dernières années, sa fréquence n’a cessé de décroître au profit de mutations localisées sur le domaine KREP. En 2018, une trentaine de mutations non-synonymes ont été associées à un phénotype de résistance dans diverses populations parasitaires d’Asie du sud-est50. Catégorisées selon leur niveau de caractérisation par des approches cliniques et des expérimentations in vitro (Encadré 4), neuf mutations non-synonymes du gène pfk13 ont été officiellement validées par l’OMS comme conférant la résistance aux ARTDs (F446I, N458Y, M476I, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, C580Y). Vingt-deux mutations supplémentaires (P441L, G449A, D452E, C469F, C469Y, K479I, A481V, R515K, S522C, P527H, N537D, N537I, G538V, V568G, P574L, R575K, M579I, D584V, P667T, F673I, A675V, H719N), considérées comme mutations de résistance « candidates » par l’OMS (Encadré 4), ont également été associées à un retard de clairance dans des études cliniques, retrouvées à des fréquences très variables dans les populations naturelles. Ces listes sont évidemment appelées à être régulièrement actualisées en fonction des nouvelles investigations réalisées dans les régions endémiques. La localisation de l’ensemble de ces mutations sur les structures secondaire et tertiaire du domaine KREP de PfK13 est indiquée en figure 11.
Figure 11 : Localisation des mutations de résistance aux ARTDs sur les structures secondaire et tertiaire du domaine KREP de PfK13. Les sites associés aux mutations de résistance aux ARTDs validées et candidates sont respectivement colorés en rouge et en orange. Les motifs kelch (ou blades) sont labellisés en chiffres romains (de I à VI) sur la structure tertiaire.
Encadré 4 : Catégorisation des mutations pfk13 associées à la résistance aux ARTDs selon divers critères érigés par l’OMS.
Mutation de résistance validée : Une mutation de résistance est considérée comme validée lorsque celle-ci répond aux deux critères suivants :
i) une association statistique (P < 0,05) entre une mutation et une demi-vie de clairance parasitaire supérieure à 5 heures chez des patients ;
ii) une association statistique (P < 0,05) entre une mutation et une sensibilité réduite aux ARTDs par des tests in vitro (RSA0-3h) à partir d’isolats parasitaires ; ou une association statistique (P < 0,05) entre une sensibilité réduite aux ARTDs et des parasites mutants pfk13 produits in vitro par des techniques de transfection et d’édition du génome.
Mutation de résistance candidate : Une mutation de résistance est considérée comme candidate lorsque celle-ci est associée statistiquement (P < 0,05) à une demi-vie de clairance parasitaire supérieure à 5 heures in vivo, mais sans validation in vitro. Cette liste inclut également les mutations retrouvées à faible fréquence dans les populations naturelles, associées à un retard de clairance mais sans soutien statistique (en raison de faibles échantillonnages).
Trois études ont examiné la diversité moléculaire de pfk13 de quelques milliers de parasites provenant d’Asie et d’Afrique114–116. Les mutations de résistance aux ARTDs décrites en Asie ne sont pas détectées en Afrique115,116. De plus, une élévation significative du taux de substitution non-synonyme par rapport au taux de substitution synonyme i pour le gène pfk13 est uniquement observée en Asie, suggérant l’absence de sélection positiveii agissant sur ce gène en Afrique115. Si quelques mutations non-synonymes de pfk13 sont rapportées en Afrique, celles-ci sont très rares et spécifiques à l’Afrique114–116. Cependant, de récentes études ont documenté des échecs thérapeutiques pour des patients porteurs de parasites mutants pfk13 infectés en Afrique, dont la mutation de résistance A675V retrouvée aussi en Asie101,117.
Jusqu’à récemment, un balayage sélectif modéré (ou soft selective sweep en anglais) était décrit comme le modèle de sélection initial agissant sur pfk13 en Asie du sud-est, avec plusieurs mutations ciblées par la sélection positive coexistant à des fréquences plus ou moins élevées113. Ce balayage sélectif s’est intensifié dans lequel seules les lignées de parasites portant la mutation C580Y se sont propagées à travers la région est de l’Asie du sud-est113. La raison pour laquelle cette mutation est plus compétitive que les autres demeure inconnue. En effet, par modification génétique de pfk13 au sein d’un isolat cambodgien adapté de longue date à la culture (souche Dd2), Straimer et al. (2015) ont montré par mesure du taux de survie RSA0-3h que cette mutation n’est pas associée à un niveau de résistance supérieur par rapport à d’autres mutations pfk13 (Figure 12)105. Les mutations R539T et I543T sont associées à un taux de survie RSA0-3h largement supérieur à 10%, contrairement à la mutation C580Y qui atteint 8%. Sachant que la protéine K13
i Mutation nucléotidique qui n’altère pas la séquence protéique (mutation silencieuse).
ii Se produit lorsqu’une mutation bénéfique survient dans une population et augmente en fréquence, généralement en raison d’un avantage sélectif est démontrée comme essentielle durant le cycle asexué érythrocytaire chez P. falciparum et P. berghei111,112, un moindre fitness costi pourrait être à l’origine du succès de C580Y par rapport aux autres mutations105,118. Diverses études ont cependant révélé des résultats contradictoires. Des expériences de compétition in vitro avec des lignées isogéniques sauvage et mutantes pfk13 (R539T, I543T ou C580Y) ont montré des déficits de croissance variables en fonction de la mutation et de la souche parasitaire testées (Figure 13A). Il a notamment été observé que C580Y avait un fitness cost supérieur à R539T lorsqu’elle est portée par la souche vietnamienne V1/S datant de 1976. En revanche, à partir de souches cambodgiennes récentes (Cam3.II et CamWT), C580Y est associée à un plus faible fitness cost par rapport aux autres mutations. Parallèlement à ce travail, Nair et al. (2018) ont comparé les fitness cost associés à C580Y et R561H119. Les mutations ont été introduites par la méthode CRISPR/Cas9 à partir d’un isolat parasitaire pfk13 sauvage provenant de la bordure Thaïlande-Myanmar. Dans cette étude in vitro, C580Y est associée à un fitness cost plus élevé que R561H, et la mutation R561H remplace C580Y lorsque les deux types de parasites mutants sont placés en concurrence directe (Figure 13B). Des analyses supplémentaires sont donc nécessaires pour mieux comprendre la relation entre les mutations pfk13, le fond génétique et le fitness du parasite.
Figure 12 : Impact de différentes mutations pfk13 sur le taux de survie RSA0–3h à partir de la souche asiatique Dd2. Seuil de significativité des tests de Student par comparaison des mutants au sauvage Dd2 : * P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001. La figure a été tirée du travail de Straimer et al. (2015)105.
i Désigne la perte de fitness d’un organisme associé à une mutation (ou un génotype) donné. Le fitness (ou valeur adaptive en français) désignant la capacité d’un organisme à survivre et à se reproduire dans un environnement donné.
Figure 13 : Fitness des parasites portant différentes mutations du gène pfk13 . (A) Les différences de taux de croissance ont été calculées en tant que pourcentage de changement de la fréquence de l’allèle mutant pfk13 par génération asexuée (48 heures) durant 60 jours de co-culture d’un mutant avec un sauvage. D’après Straimer et al. (2017)120. (B) Résultats de la compétition entre parasites sauvages vs. mutants et mutants vs. mutants. Les valeurs sont exprimées par des coefficients de sélection. Chaque expérience de compétition a été réalisée en six réplicats (points gris), avec les résultats de la méta-analyse (points rouges) . Le génotype associé à un meilleur fitness est indiqué à droite pour chaque comparaison. D’après Nair et ses collègues (2018)119.
Le rôle de PfK13 dans la biologie du parasite : un comparatif sauvage versus mutant
La fonction physiologique de PfK13, protéine essentielle chez P. falciparum111, n’est pas encore bien comprise. Toutefois, différents travaux ont démontré plusieurs fonctions de régulation de PfK13. L’invalidation fonctionnelle de cette protéine, par le biais d’une mauvaise localisation dans la cellule ou par un knock-out (KO) inductible, conduit à un arrêt précoce du cycle intra-érythrocytaire au stade ring, suivi d’une transformation lente des jeunes rings en formes pycnotiques121. Cet arrêt de croissance des parasites induit par l’inactivation de PfK13 est cohérent avec le phénotype de résistance aux ARTDs médié par pfk13 qui s’exprime principalement au stade jeune ring122. De même, l’étude de parasites mutants pfk13 résistants révèle un allongement de la durée du stade ring, tandis que celles des stades trophozoïte et schizonte se trouvent elles raccourcies, par rapport aux parasites sauvages123. Par analyse du transcriptome in vivo de 1 043 isolats P. falciparum collectés chez des patients atteints de paludisme non compliqué, il a été constaté que la résistance aux ARTDs est associée à une expression accrue des gènes impliqués dans la voie cellulaire Unfolded Protein Response (réponse UPR), impliquant plusieurs protéines chaperonnes dont la fonction est d’assister d’autres protéines dans leur maturation124. En effet, le stimulus causé par les ARTDs semble perturber le bon repliement des protéines, conduisant à l’activation d’une cascade de voies de signalisation – constituant la réponse UPR – pour diminuer la biosynthèse des protéines afin d’en réduire leur accumulation tout en augmentant la biosynthèse de protéines chaperonnes ou de protéines impliquées dans la machinerie de dégradation des protéines. Ces résultats sont cohérents avec les travaux de Zhang et ses collaborateurs (2017)123, lesquels démontrent une phosphorylation du facteur d’initiation 2A (PfeIF2α), par la kinase PfPK4 et régulant la réponse UPR chez le parasite mutant C580Y au stade jeune ring (à partir d’une souche parasitaire Dd2). Au final, tous ces éléments suggèrent que le parasite résistant aux ARTDs modifie son cycle cellulaire de sorte qu’il passe plus de temps à un stade de son développement qui est moins sensible aux ARTDs (ring), tout en préparant une réponse atténuant les dommages causés par la molécule.
Dogovski et al. (2015) ont montré une diminution de l’accumulation de protéines parasitaires ubiquitinées chez les parasites mutants pfk13, relativement aux sauvages, après une brève exposition (1,5 heures) à une forte concentration d’ART (1 µM), suggérant que la voie du protéasome a également un lien avec la résistance125. PfK13 pourrait donc contrôler – directement ou indirectement – le niveau d’ubiquitination de protéines cibles. L’une d’entre elles pourrait être l’enzyme phophatidylinositol-3 kinase (PfPI3K), qui a été immunoprécipitée avec PfK13, indiquant une interaction – directe ou non – entre ces deux protéines. L’ubiquitination et la dégradation par le protéasome de la PfPI3K sont par ailleurs diminuées chez les parasites pfk13 C580Y126. L’augmentation du taux cellulaire de PfPI3K entraîne un accroissement de la concentration cellulaire de son produit lipidique, le phophatidylinositol-3 phosphate (PI3P), qui est corrélée avec le degré de résistance in vitro. Cette observation fut par la suite confirmée via des élévations synthétiques de ce lipide en l’absence de mutations pfk13127. Un récapitulatif du lien entre les différentes voies métaboliques liées aux mutations pfk13 est présenté en figure 14.
Un lien entre le lipide PI3P et la voie UPR – représentant actuellement deux facteurs clés de la résistance aux ARTDs – a récemment été proposé. Par microscopie immuno-électronique à haute résolution, Bhattacharjee et al. (2018) ont démontré que PfK13 se concentre au niveau des vésicules PI3P du réticulum endoplasmique (RE)127. L’isolement de ces vésicules et leur analyse par protéomique ont permis de déterminer qu’elles sont enrichies en de multiples systèmes protéostasiquesi tels que l’exportation de protéines, le contrôle de la qualité et du repliement des protéines dans le RE et le cytoplasme, et les voies de signalisation relatives à la réponse UPR. De façon remarquable, les vésicules PI3P atteignent, une fois amplifiées, tous les compartiments cellulaires chez les mutants pfk13 C580Y. L’ensemble de ces données suggère que l’expansion des vésicules PI3P – liées à la protéostasie du RE – associée à la mutation pfk13 C580Y dissémine une capacité protéostatique étendue incluant la réponse UPR, pouvant neutraliser la protéopathie toxique des ARTDs.
Table des matières
1. Introduction
1.1. Généralités sur le paludisme
1.1.1. L’histoire du paludisme
1.1.2. Épidémiologie de la maladie
1.1.3. Biologie du parasite Plasmodium
1.1.4. Signes cliniques et méthodes de diagnostic
1.1.5. De la prévention aux traitements curatifs
1.1.6. Historique d’utilisation des antipaludiques et d’apparition des résistances Les points essentiels
1.2. L’ART, de sa découverte à la chimiorésistance des parasites
1.2.2. Mode d’action des ARTDs
1.2.3. De la monothérapie d’ART aux CTAs
1.2.4. Émergence et caractérisation de la résistance aux ARTDs
1.2.5. La découverte d’un déterminant moléculaire de la résistance aux ARTDs : le gène pfk13
1.2.6. Le rôle de PfK13 dans la biologie du parasite : un comparatif sauvage versus mutant
1.2.7. D’autres déterminants moléculaires de résistance aux ARTDs à venir ?
Les points essentiels
1.3. PfCRT, une protéine de transport impliquée dans la résistance à de multiples antipaludiques à base de quinoléine
1.3.1. Découverte et développement des médicaments à base de quinoléine
1.3.2. Mode d’action des quinoléines
1.3.3. Rôle physiologique de PfCRT, transporteur impliqué dans la résistance aux médicaments à base de quinoléine
1.3.4. Caractérisation de la résistance à la CQ, conférée par les mutations du gène pfcrt
1.3.5. Évolution des mutants pfcrt et émergence de résistance à d’autres antipaludiques à base de quinoléine
Les points essentiels
1.4. Justification et objectifs du projet de thèse
1.4.1. Problématique générale
1.4.2. Quelles sont les régions et sites potentiellement impliqués dans la fonction physiologique de PfK13 et PfCRT ?
1.4.3. Quel est l’impact des mutations de résistance sur la structure tertiaire des protéines PfK13 et PfCRT ?
1.4.4. Congrès et publications
2. Méthodologie
2.1. La bioinformatique, de la théorie à la pratique
2.1.1. Mesure des pressions de sélection agissant sur les gènes pfk13 et pfcrt
2.1.2. Mesure de la vitesse d’évolution dans un contexte structural de PfK13 et PfCRT
2.1.3. Approche comparative évolutive et structurale pour la recherche de sites fonctionnels candidats
2.1.4. Prédiction de la structure tertiaire des protéines
2.1.5. Mesures biophysiques à partir des structures tertiaires de PfK13 et PfCRT
2.1.6. Simulations de dynamique moléculaire du domaine KREP de PfK13
2.1.7. Docking moléculaire sur le domaine KREP de PfK13
Les points essentiels
2.2. De la bioinformatique à la biochimie
2.2.1. Introduction au pull-down
2.2.2. Construction des plasmides
2.2.3. Transformation par choc thermique dans les souches d’expression
2.2.4. Optimisation des conditions d’expression des domaines recombinants
2.2.5. Solubilisation des domaines recombinants
2.2.6. Purification des domaines recombinants
2.2.7. Préparation du lysat parasitaire
2.2.8. Réalisation du pull-down
3. Résultats
3.1.Études bioinformatiques et expérimentales sur la protéine PfK13
3.1.1. Recherche des zones conservées de PfK13
3.1.1.1. La haute conservation de k13 au cours de l’évolution des Apicomplexa
3.1.1.2. Un domaine coiled-coil fortement conservé
3.1.1.3. Les similitudes du domaine BTB de PfK13 avec celui des protéines KCTD
3.1.1.4. La poche du domaine KREP de PfK13, une possible surface d’interaction protéine-protéine
3.1.2. Les mutations de résistance aux ARTDs n’altèrent pas les propriétés structurales de la poche du domaine KREP de PfK13
3.1.3. Article 1
3.1.4. Analyses expérimentales de la poche du domaine KREP de PfK13
3.1.4.1. Analyses de pull-down
3.1.4.1.1. Expression des domaines recombinants PfK13
3.1.4.1.2. Solubilisation des domaines recombinants PfK13
3.1.4.1.3. Purification des domaines recombinants PfK13
3.1.4.1.4. La première analyse de pull-down
3.1.4.1.5. Le problème des contaminants bactériens après purification
3.1.4.2. Recherche d’inhibiteurs de la poche du domaine KREP de PfK13 ?
Les points essentiels
3.2. Analyses évolutives et structurales de PfCRT
3.2.1. À la recherche d’une région fonctionnelle de PfCRT
3.2.1.1. Forte conservation de la moitié vacuolaire de CRT
3.2.1.2. Prédiction de différents états conformationnels de la structure tertiaire de PfCRT
3.2.1.3. Prédiction de sites fonctionnels de PfCRT
3.2.1.4. Un potentiel électrostatique altéré chez les structures PfCRT portant les mutations de résistance aux médicaments à base de quinoléine
3.2.2. Article 2
4. Discussion
4.1. Explications et perspectives des méthodes bioinformatiques
4.1.1. Sélection purificatrice : contrainte structurale ou fonctionnelle ?
4.1.2. Une nouvelle option pour la détection de patchs de sites conservés
4.1.3. Étude comparative des niveaux de sélection purificatrice aux échelles inter- et intra-espèces
Les points essentiels
4.2. Quel avenir pour les protéines PfK13 et PfCRT
4.2.1. Quelle(s) relation(s) entre la fonction de PfK13, la poche du domaine KREP, et les mutations de résistance aux ARTDs ?
4.2.1.1. PfK13 et sa possible participation dans un complexe d’ubiquitination
4.2.1.2. Vers une validation expérimentale du rôle de la poche du domaine KREP de PfK13
4.2.1.2.1. Approches biochimiques : pull-down et pull-down différentiels
4.2.1.2.2. Approche génétique : étude de parasites P. falciparum génétiquement modifiés
4.2.1.2.3. Approche pharmacologique : recherche d’inhibiteurs de la poche
4.2.1.3. Les mutations de résistance aux ARTDs : l’hypothèse d’une déstabilisation structurale du domaine KREP de PfK13
4.2.2. Quel lien entre la poche de PfCRT et sa fonction de transport ?
4.2.2.1. La poche de PfCRT, coeur de son activité ?
4.2.2.2. Validation des sites fonctionnels candidats
4.2.2.3. La relation entre la structure tertiaire de PfCRT et les mutations de résistance aux médicaments
4.2.3. PfK13 et PfCRT, de possibles cibles thérapeutiques
Références bibliographiques
Annexes
