CARACTERISATION DE LA DIVERSITE, DE LA DIFFERENCIATION ET DE L’EVOLUTION DU CANCER

CLASSIFICATION MOLECULAIRE

Les technologies à haut débit ont démontré l’hétérogénéité du sein au niveau moléculaire et conduit à des changements dans les théories antérieures de la biologie du cancer du sein. Les études mondiales de profilage de l’expression génique ont classé les cancers du sein en 5 soustypes intrinsèques par regroupement hiérarchique, à savoir les cancers du sein luminal A, luminal B, surexprimant HER2, basal-like (BLBC) et les tumeurs de type normal (17). L’expression du RE (récepteur d’oestrogene) stratifie les cancers du sein en 2 groupes distincts : ER+ et ER−. Les sous-types. Luminal A et B ont été enrichis avec ER-positifs, alors que surexprimant HER2, BLBC et les tumeurs de type normal étaient ER-. En dehors de l’expression des gènes ER et liés à l’ER, différents sous-types ont montré une expression différentielle des gènes liés à la prolifération, HER2 amplicon et les cellules myoépithéliales. Ces différents sous-types intrinsèques ont révélé des différences d’incidence, de caractéristiques cliniques et pathologiques et, dans une large mesure, se chevauchaient avec les activations. Le Luminal A est le sous type moléculaire le plus courant, il représente 40 à 50 % des cancers du seins invasifs. Typiquement, les cancers luminaux. A sont de faible grade, avec le meilleur pronostic parmi tous les sous-types intrinsèques. Les cancers Luminaire B ont tendance à être de grade plus élevé et ont un plus mauvais pronostic que luminal A. Cliniquement, le groupe luminal A est susceptible de bénéficier de l’hormonothérapie seule, alors que les tumeurs luminales B peuvent être candidats à une chimiothérapie supplémentaire (13,17,18). Le sous-type surexprimant HER2, représentant ∼ 15 % de tous les cancers du sein invasifs, il se caractérise par la surexpression des gènes associés à la signalisation HER2/HER2 et des gènes situés dans l’amplicon HER2 sur le chromosome 17q12. Les tumeurs surexprimant HER2 sont susceptibles d’être de haut grade, ER et PR−, et suivre un cours clinique agressif. Néanmoins, ils sont très réactifs aux anti-HER2-ciblés thérapie, ce qui améliore considérablement les résultats. Tous les cancers du sous-type surexprimant HER2 ne sont pas cliniquement HER2+ et vice versa. Une minorité de cancers HER2-positifs coexpriment le RE et sont classés comme luminaux B (13,18,19). Les BLBC sont associés à l’expression des gènes dans les cellules basales/myoépithéliales mammaires normales, y compris cytokératines basales. Ils montrent également une surexpression de gènes liés à la prolifération mais sans ER, PR et HER2-expression génique associée. Histologiquement, les BLBC sont généralement de haut grade, avec un indice de 8 prolifération élevé et présentent un phénotype triple négatif. Les patients BLBC ont un mauvais pronostic, et des rechutes peuvent survenir dans les 5 ans suivant le diagnostic (13,17,20). Le type normal-like est caractérisé par l’expression de gènes similaires à la normale épithélium mammaire. Cependant, il s’agit d’un sous-groupe controversé et a été plus tard considéré comme un artefact

GENTIQUE ET CANCER DU SEIN

HEREDITE ET CANCER DU SEIN

La forme héréditaire du cancer du sein représente 5 à 10% des cas de cancer du sein. La majorité de forme héréditaire résulte de modification de deux gènes : BRCA1 et BRCA2 (21). BRCA1 et BRCA2 sont des gènes suppresseurs de tumeurs indispensable à la réparation des cassures d’ADN double brin par recombinaison homologue (22) Cependant, le BRCA1 est également connu pour plusieurs autres fonctions cellulaires importantes pour le maintien de l’intégrité génomique, notamment l’assemblage du fuseau mitotique, la duplication des centrosomes, le contrôle du cycle cellulaire et le remodelage de la chromatine sur les sites de rupture de l’ADN double brin (23) . Outre le rôle précédemment cité, les fonctions du BRCA2 ne sont pas encore entièrement connues. IL semble principalement réguler la formation du filament RAD51 – Cette étape est critique pour catalyser l’invasion des brins et initier la recombinaison homologue. Les cellules dépourvues de BRCA1 ou BRCA2 sont incapables de réparer les cassures double brin par recombinaison homologue et, par conséquent, la réparation s’effectue par des voies sujettes aux erreurs, telles que la jonction d’extrémités non homologues (21). Ces cellules peuvent subir des mutations lors de la réparation des brins et accumulent souvent des réarrangements chromosomiques au cours des cycles successifs de division cellulaire (22). Alors que la majorité de ces réarrangements entraînent la mort cellulaire, dans certains cas, les cellules filles mutantes sont stables et conduisent à l’émergence d’une lignée cellulaire dominante qui acquiert les capacités de division cellulaire autonome et de potentiel métastatique, deux des caractéristiques du cancer (23). BRCA1 s’est également avéré nécessaire pour l’activation de l’arrêt du cycle cellulaire en phase S et G2/M après des dommages à l’ADN, ce dernier dépendant de la phosphorylation préalable de BRCA1 par le point de contrôle maître kinase ATM (24). 9 Des mutations au niveau de ces gènes conduisent à une prédisposition au cancer du sein et augmentent ainsi le risque d’en développer. En effet. 75% des femmes présentant des mutations au niveau de ces gènes développent le cancer du sein 

INSTABILITE DU GENOME MITOCHONDRIAL ET NEAPLASIE

L’ADNmt humain est une molécule bicaténaire, circulaire et fermée de 16 569 paires de nucléotides (pb). Il code pour un petit-sous unités (12S) et un grand sous unités d’ARNr (16S), 22 ARNt et 13 polypeptides. Tous les polypeptides codés par l’ADNmt sont des sous-unités de la phosphorylation oxydative (25). L’ADNmt humain possède un taux de mutation au moins 10 fois plus élevé que l’ADN nucléaire (26). Des réarrangements complexes et des substitutions à base unique dans l’ADNmt mitochondrial sont associés à un certain nombre de maladies dégénératives sporadiques et héréditaires maternelles qui affectent les tissus fortement dépendants de la bioénergétique de l’ADNmt (27). Très probablement, ces mutations sont liées à la forte production d’espèces réactives de l’oxygène dans la mitochondrie (28) et à un système de réparation de l’ADN moins efficace que celui de l’ADN nucléaire (29). Les variantes génétiques qui surviennent dans la lignée germinale femelle sont transmises à la génération suivante, où elles peuvent être observées sous forme de nouveaux polymorphismes ou de maladies mitochondriales (27). Des mutations peuvent également survenir dans les tissus somatiques, et elles semblent s’accumuler avec l’âge dans certains systèmes (25). Des mutations somatiques de l’ADNmt ont été observées dans les néoplasies humaines 

ROLES DU CYT.B DANS SURVENUE DU CANCER DU SEIN

Le Cyt.B ou encore le Mt-Cyb est un gène mitochondrial de 1140 pb qui code pour une protéine de même nom (30). Il joue un rôle vital rôle dans l’assemblage et la fonction du complexe-III, un des cinq complexes du système de phosphorylation oxydative (31). Avec le Cytochrome c1 et la protéine fer-soufre, il forme le noyau catalytique des enzymes (32). Des mutations du gène Cyt.B sont associées à une déficience du complexe combiné I+III ou du complexe III uniquement (33). Ceci a pour conséquence le blocage du flux d’électrons dans la chaîne de transport d’électrons, provoquant une augmentation de la production de ROS et contribue ainsi à la survenue du cancer (28,34). De plus, la surexpression de Cyt.B entraine une augmentation ROS accompagnée d’une augmentation consommation d’oxygène et production de lactate (25). Le Cyt.B , surexprimé induit une croissance tumorale significative in vitro et in vivo en déclenchant progression significative du cycle cellulaire grâce à une régulation à la hausse des voie de signalisation du facteur NFκB2 (31). 

MATERIELS ET METHODE

POPULATION D’ETUDE

La population de cette étude est constituée par 75 femmes vivant au Sénégal. Cet échantillon total est scindé en un groupe témoin de 37 individus et un groupe de 38 individus ayant le cancer du sein. Les prélèvements ont été obtenus après un consentement libre et éclairé des volontaires.

ETUDE GENETIQUE 

Extraction d’ADN

L’extraction de l’ADN a été faite suivant le protocole standard Quiagen. Tous d’abord les tissus ont été noyés dans une solution de tampon de digestion et le mélange incubé au bain marie à 55° C durant tout une nuit. Cette étape permet de séparer les cellules initialement jointes. 20µl de protéinase k ont été ajoutées pour dégrader toutes les protéines. Pour se débarrasser des déchets tissulaires le mélange a été centrifugé à 1361,35688 radians/seconde durant une minute puis on a récupéré le surnageant. Sur celui-ci on a ajouté 200µl de tampon de lyse cellulaire (AL), ce mélange a été incubé à 70° durant 10mins après avoir vortexer pendant 15 secondes. La phase suivante a consisté à ajouter 200µl d’éthanol absolu 70° dans le mélange et transvaser le tout, après vortex, dans une colonne contenant une membrane de silice placé au préalable dans un tube de 2ml (fourni par le kit). Cette étape permet de retenir l’ADN au niveau de la membrane siliceux. En effet, ADN étant chargé négativement est retenu au niveau de la membrane par la silice qui est chargé positivement. Le tube colleteur a été jeté et la colonne placer dans un nouveau. Pour purifier l’ADN fixer sur la membrane de la colonne plusieurs séries de lavage ont été effectuées, d’abord 500µl du tampon AW1 ont été ajoutés puis après centrifugation à 1361,35688 radians/seconde pendant 1min on a ajouté 500µl du tampon AW2 et on a centrifugé de nouveau pendant 3min. Pour décoller l’ADN de la membrane du colonne, 200 µl de tampon d’élution ont été versé à travers la membrane siliceuse. Le tampon a été préalablement incuber à 70°c pour augmenter le rendement de 15 à 20 %. L éluât fut ainsi recueillis dans un tube de 1,5 ml et conservés à -20°c. Pour vérifier la qualité de l’ADN obtenue une migration électrophorétique a été effectuée. Elle consiste en une séparation des fragments d’ADN qui migre sur un support solide soumis à un champ électrique. En effet les molécules d’ADN étant de charge négative vont migrer vers 12 l’anode du champ électrique. Plus le fragment est lourd moins vite il migre vers le pôle positif ainsi on peut estimer la taille des fragments à l’aide du marqueur de taille smart ladder 200pb. 7 µl d’extrait ont été ajoutes mélanges avec 3µl de bleu de bromolphenol (bleu de charge) puis déposer sur les puits du gel d’agarose 1% et migrer à 100 volts pendant 30 à 35mn. La révélation s’est faite dans une chambre noire, sous UV après passage dans un bain de bromure d’éthidium. III-2-2 AMPLIFICAION DU GENE CYT B LA PCR (Polymérase Chain Réaction) est un procédé permettant d’amplifier une séquence d’ADN cible à partir d’une petite quantité ADN génomique. Elle a pour principe l’élongation des amorces par une polymérase en présence de dNTPs et de Mg2+. Le gène d’intérêt de cette étude est le Cyt.B, un gène de l’ADN mitochondriale de plus de mille paires de bases. Les réactifs et les volumes utilisés sont illustrés dans le tableau I.