Circular Polymerase Extension Cloning : CPEC

Principe

Le but du CPEC est de rassembler plusieurs amplicons obtenus après RT-PCR dans le bon ordre dans un vecteur (180). Pour déterminer cet ordre les fragments de RT-PCR sont conçus pour avoir des extrémités chevauchantes entre un fragment et celui qui le suit dans l’ordre de la construction voulue. Le premier et le dernier fragment de RT-PCR ont des extrémités chevauchantes avec le vecteur. Lorsque les fragments sont en solution, ils s’apparient et l’ADN polymérase fait l’élongation de l’ensemble apparié (figure 20). 

Constructions

 Nous nous sommes orientés vers l’utilisation d’un polylinker (figure 21), obtenu par synthèse de gène auprès de la société Genecust, pour la création des chimères (181). Celui-ci facilitera l’expression des constructions qui sont transfectées dans des cellules eucaryotes, ici dans des cellules HEK 293T : cellule de rein embryonnaire humain.

Productions des virions recombinants

Production des virus issus des plasmides 

Des transcrits ARN ont été produits à partir des constructions obtenues avec les méthodes classiques de clonage à l’aide d’un kit Sp6 (Ambion Megascript Sp6®) selon les recommandations du fournisseur. Les ARNs ainsi obtenus ont ensuite été électroporés dans des cellules VERO (cellules permissives pour le virus West Nile, déficiente en interféron provenant de reins de singes verts africains, et immortelles car dérivant de cellules tumorales), selon le protocole suivant. Les cellules ont été lavées deux fois en PBS (-Ca -Mg, qualité culture cellulaire, Thermo Fisher Scientific), puis trypsinées et resuspendues dans 10 mL final avec du milieu complet (DMEM High Glucose, 5%SVF, 1% pénicillin/streptomycine) et enfin transférées dans un tube falcon de 50mL. Les cellules sont gardées sur la glace. Les cellules ont été comptées sur cellules de Malassez, puis centrifugées à 4°C et 1500 rpm, pendant 5 min. Le surnageant a été retiré puis les cellules ont été resuspendues dans 50 mL de PBS et l’opération a été répétée trois fois. Finalement les cellules ont été resuspendues à 1.5×107 cellules/mL en PBS froid. Les cuvettes d’électroporation (Gene Pulser® Cuvette, Bio-Rad) sont conservées à température ambiante (cuvettes 0.4 mm) et une électroporation à la fois est réalisée. Les ARN sont ajoutés sur les cellules, juste avant l’électroporation. Deux témoins sont systématiquement réalisés, pour chaque série d’électroporation, à savoir un témoin sans ARN et 1 témoin sans cellules (20µL d’ARN et 400µL de milieu). J’ai disposé 400 µL de cellules VERO par cuvette d’électroporation auxquels j’ai ajouté 20 µL d’ARN, en assurant un bon mélange de la réaction par pipetage. L’appareil d’électroporation a été réglé à 25 µF, 0.29 kV, puis 4 pulses ont été appliqués à 4 secondes d’intervalle. Les cellules ont été transférées dans 10 mL de milieu complet avec 2% Sérum de Veau Fœtal, SVF, puis dans une flasque de culture 25cm2 . Les flasques ont été transférées en laboratoire confiné de niveau 3, dans une étuve CO2, à 37°C. Ces boîtes correspondaient au passage 0 (P0). Après 24h de nouvelles flasques 25cm2 de Page 69 sur 125 cellules VERO ont été préparées, puis 24h plus tard j’ai prélevé le surnageant des P0 (les 2 flasques P0 effectuées pour un plasmide donné ont été regroupées), centrifugé les surnageants 5 min à 2500 rpm et réalisé des aliquots de 500 µL et de 50 µL (x20). Les productions P0 ont été stockées à -80°C. Les P0 ont été amplifiés par un passage supplémentaire sur cellules VERO (cf.fig22). Trois nouvelles flasques 25cm2 (P1) (passage de travail) ont été lavées avec 1 mL DMEM puis infectées avec un mélange de 500 µL P0 et 500 µL de milieu DMEM sans SVF. Les flasques P1 ont été incubées pendant 1h30 à 37°C, sous atmosphère enrichie en CO2. Deux lavages de 5 min ont été effectués avec 2 mL DMEM puis 5 mL de milieu complet (2% SVF) ont été ajoutés dans chaque flasque. Après 72h, les surnageants P1 ont été prélevés et des aliquots de 50 µL ont été constitués. Ces surnageants ont été titrés sur cellules VERO. Les constructions obtenues avec la méthode CPEC ont été transfectées avec la Lipofectamine LTX et Plus reagent® (Thermo Fisher Scientific) selon la méthodologie suivante. A J-1, des plaques 6 puits ont été préparées par l’ajout de 600 000 cellules/puits de cellules HEK 293T sous 3-4mL de milieu. J0 : J’ai réalisé la dilution du Lipofectamine LTX Reagent en Opti-MEM (solution A) : Pour un puits : -140µL d’opti-MEM -10 µL de LTX Parallèlement j’ai réalisé la dilution de l’ADN à transfecter dans le plus Reagent en Opti-MEM (solution ADN) : Pour un puits : -2500ng ADN -2.5µL Plus Reagent -Opti-MEM qsp 150µL Puis j’ai mélangé volume à volume la solution A et la solution d’ADN : Pour un puits : -150µL solution ADN -150µL solution A Les mélanges ont été incubés 5 min à température ambiante puis déposés dans un puits d’une plaque 6 puits (300µL). Les plaques 6 puits ont été transférées en laboratoire confiné de niveau 3, dans une étuve à CO2, à 37°C. Des ECP ont pu être visualisés dans les puits avec plasmide après 2 à 4 jours de culture. A leur apparition j’ai récolté et aliquoté les surnageants (4mL) par 100µL, 500µLet 1mL. Les virus chimères ainsi produits ont ensuite été amplifiés sur cellules VERO comme décrit dans la section « a » (P1). Tous les virus chimériques obtenus ont été titrés sur cellules Vero et les titres infectieux ont été calculés en DECP50 selon la méthode Reed et Muench décrite plus bas. Afin de déterminer les différences de virulence entre nos différentes productions de virus, des essais en culture cellulaire (in vitro) et des méthodes de détermination de virologie classique ont été utilisées tels qu’une RT-qPCR et un titrage DECP50 (titrage de la suspension virale en particules infectieuses) permettant de confirmer la capacité réplicative du virus. Dans le même but, un essai d’infection de cellule avec visualisation des plages de lyse formées après infection d’une cellule par une particule infectieuse et diffusion de proche en proche des néovirions produits a été effectué. Ensuite, des essais in vivo (évaluation dans un modèle murin et aviaire) ont été réalisés afin de voir si les observations faites in vitro étaient corrélées ou non avec des différences de virulence in vivo. 

Détermination de la virulence in vitro (titrages et cinétique de réplication virale) 

Culture cellulaire et infection par les différentes souches de virus 

Les cellules VERO ou HEK 293T ont été cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle’s Medium) supplémenté avec 5% ou 10 % de SVF (cellules VERO et HEK 293T respectivement), 1% de pénicilline/streptomycine (antibiotiques), 1 % L-Glutamine (acide aminé rajouté pour les cultures de cellules HEK 293T uniquement) et 1% de pyruvate (apport énergétique : sucre) (Thermo Fisher Scientific). Lors des passages bi-hebdomadaires, les cellules ont été lavées avec du PBS stérile, trypsinées (désagrégation du tapis adhéré sous l’action de la trypsine) et remises en culture dans du milieu neuf. Ces différentes cultures cellulaires nous ont servis pour les différents essais in vitro cités ciaprès. 

Cinétiques de réplication virale en cellules VERO 

Les infections virales ont été réalisées dans des plaques de culture cellulaire 12 puits. Les cellules trypsinées sont re-suspendues dans un volume de 10 mL de milieu complet, et diluées au 1/10eme dans un colorant vital, le bleu Trypan, afin de pouvoir les quantifier en cellule de Malassez (10µL de culture cellulaire dans 90µL de bleu de trypan, les cellules mortes apparaissent bleues au microscope). Puis une suspension cellulaire à 4 x 106 cellules/mL a été réalisée et 4 x 105 cellules/puits ont été distribuées sous 1mL de milieu complet. Les plaques ont ensuite été placées à l’étuve pendant 24h à 37 °C. Puis ces cellules ont été infectées, en laboratoire confiné, avec différentes productions de VWN : deux isolats naturels du virus West Nile (Is98 et It08) ainsi que les chimères 3 et 4. Ces différentes productions ont été testées à plusieurs MOI (Multiplicité d’infection) : 1, 0.1 et 0.01 MOI. Une MOI de 1 correspond à une particule infectieuse par cellule, soit pour 4 x 105 cellules/puits une quantité de 4 x105 PFU/puits. Les différentes dilutions ont ensuite été ajoutées aux différents puits des plaques de culture cellulaire préparées le jour précédent, afin de démarrer une cinétique d’infection. Les plaques ont ensuite été mises à l’étuve à 37°C et le surnageant de chaque puits a été prélevé (150 µL pour l’extraction d’ARN pour la RT-qPCR et 3 x 50µL pour le titrage DECP50) à 24h, 48h et 72h postinfection afin de suivre la cinétique d’amplification de chaque virus. Après chaque prélèvement, les puits sont complétés avec autant de milieu neuf que prélevé. 

Titrage DECP50

Les cellules qui apparaissent normalement plates, confluentes et, peu réfringentes, s’arrondissent, deviennent réfringentes et se détachent du support dans le milieu de culture après infection virale. Ici le titrage DECP50 a consisté en la mise en culture de cellules VERO (cellules permissives pour le VWN) avec nos différentes souches de virus (Is98, It08, Chimère 3 et Chimère 4). Chaque souche a été testée à différentes MOI (0.01, 0.1, et 1 MOI). De plus, chaque condition a été testée deux fois (a et b). Les virus utilisés proviennent des infections faites précédemment et dont on a récupéré les surnageants à différents temps post-infection (24, 48 et 72h post-infection). Les réactifs et matériels utilisés pour le titrage des particules virales infectieuses en DECP50 sont : – Du milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle’s Medium) supplémenté avec 5% de SVF, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1% de pyruvate. – Une culture cellulaire de cellules VERO à 2 x 105 cellules/mL – Les différents surnageants provenant des infections de cultures cellulaires à différentes MOI. – Plaques 96 puits à fonds plats, adaptées à la culture cellulaire. – un Poste de Sécurité Microbiologique en laboratoire confiné de niveau 3. – Micropipettes. Les plaques ont été séparées en 3 sections (Figure 23). Chaque section correspondra à un virus et à une MOI donnée. Des réplicats de chaque condition expérimentale ont été réalisés. 198 µL de DMEM supplémenté ont été ajoutés dans 7 puits de la première colonne de chaque section de la plaque. Dans le premier puits de ces colonnes, 218 µL de DMEM ont été ajoutés. Dans le premier puits des premières colonnes de chaque section, 2,2 µL de chaque surnageant viral ont été déposés dans les sections correspondantes. Il s’agit là de la première dilution au 100ème. A partir de ces puits, des dilutions successives des différents virus ont été faite en prélevant 22 µL du premier puits et en les transvasant dans les puits suivants (figure 23). La même chose a été faite jusqu’à la dilution 10-9 . 22 µL ont été retirés du dernier puits et jetés. Chaque puits contient donc un volume de 198 µL final qui va être réparti en 3 fois 50 µL dans les colonnes suivantes (figure 23). Puis 100 µL d’une culture cellulaire à 2×105 cellules/mL sont ajoutés dans chaque puits de la plaque et celle-ci est placée à l’étuve à 37°C pendant 3 jours.