Cycline G et le maintien de l’homéostasie des tissus au cours du développement chez drosophila melanogaster
Contrôle de la taille finale des organes chez Drosophila melanogaster
Au cours du développement, la forme, la taille et l’identité des tissus sont finement régulées afin de permettre la formation d’organes fonctionnels. Ces mécanismes impliquent une coordination entre la prolifération des cellules et leur croissance, c’est-à-dire l’augmentation de masse. Un premier niveau de régulation permet l’organisation des cellules au sein du tissu et implique des interactions à faible distance entre les cellules. De plus, des signaux systémiques, tels que les hormones, assurent la synchronisation du développement et l’harmonisation de la taille finale des différents organes d’un même individu. Le développement intègre ainsi des signaux extrinsèques, permettant une adaptation de l’organisme à son environnement, en fonction par exemple de la température, de l’abondance de nutriments ou de la densité de population du milieu. Dans cette partie, je commencerai par décrire le développement de Drosophila melanogaster, un organisme modèle dont l’étude a largement contribué à l’établissement des connaissances actuelles sur la régulation de la taille finale des organes et sur l’homéostasie des tissus. Puis je décrirai différents niveaux de régulation de la taille des organes : le contrôle de la prolifération cellulaire, la régulation de la croissance des organes et enfin la balance entre survie et mort cellulaire au cours du développement.
Le modèle d’étude Drosophila melanogaster
La drosophile est un insecte holométabole : son développement présente trois phases larvaires (L1 à L3), suivies d’une phase immobile (pupe) durant laquelle a lieu la métamorphose, qui aboutit à la formation de l’individu adulte, ou imago. La durée du cycle de développement de la drosophile varie en fonction de la température : elle est par exemple de 10 jours à 25°C et de 20 jours à 18°C. A 25°C, les stades larvaires débutent 24h après la ponte des œufs. Les deux premiers stades larvaires durent chacun 24h, tandis que le troisième stade dure 48h.Les larves présentent des tissus dits imaginaux, composés de cellules diploïdes et qui sont les précurseurs des structures adultes (Figure 1). Ces disques imaginaux sont issus de groupes de cellules déterminées durant l’embryogenèse. Ils présentent une prolifération très intense pendant le développement larvaire, et voient leur nombre de cellules multiplié par un facteur 1000 environ en 4 jours. Simultanément, les cellules acquièrent leur identité, mais la différenciation n’a lieu qu’à la fin de la vie larvaire ou durant la métamorphose. A la fin du troisième stade larvaire, les larves s’éloignent de la source de nourriture et s’immobilisent pour former une pupe. Au cours de la métamorphose, une partie des tissus larvaires subissent une histolyse, tandis que les tissus imaginaux se réorganisent et se différencient afin de former les structures de l’adulte. A l’issue d’une pupaison de 5 jours, l’adulte émerge de la pupe. La rapidité du cycle de vie de la drosophile, sa petite taille, la conservation d’un grand nombre de processus biologiques et la richesse des outils disponibles en font un modèle de choix en génétique et en biologie du développement, particulièrement adapté à l’étude du maintien de l’homéostasie des tissus. Par exemple, l’aile de drosophile est un modèle d’étude qui a largement contribué à la compréhension actuelle des mécanismes impliqués dans le contrôle de la taille des organes. Cet appendice, plan et facilement observable chez la drosophile adulte, a permis de réaliser des cribles d’identification de mutations affectant la taille ou la morphologie des organes. Ces recherches ont abouti à la caractérisation de différents gènes et voies de signalisation impliqués dans la régulation de la taille finale des organes, dont un grand nombre sont conservés chez les vertébrés. 1.2 Contrôle du cycle cellulaire et de la prolifération Le cycle cellulaire désigne une succession d’étapes finement régulées permettant l’augmentation du nombre de cellules par division, ou prolifération cellulaire. Le cycle cellulaire canonique est composé d’une phase de synthèse de matériel génétique (phase S), pendant laquelle l’ADN est répliqué, et d’une phase de mitose (phase M) précédées respectivement des phases de croissance G1 et G2 (Figure 2). Des variations du cycle cellulaire sont observées à différentes étapes du développement ou dans certains tissus. L’entrée en phase S requiert la phosphorylation de RBF par Cycline D/CDK4/6, ce qui lève l’inhibition de E2F1, un facteur de transcription dont les gènes cibles (tels que CycE) sont impliqués dans l’entrée en phase S. Dacapo/p27 (Dap) est également impliquée dans le contrôle de la transition G1/S, en inhibant l’activité de Cycline E/CDK2. Le complexe Cycline A/CDK2 régule la progression de la phase S. Puis Cycline A s’associe à CDK1 lors de la phase G2. La kinase Wee1 inhibe CDK1 pendant la phase G2. La phosphatase String/Cdc25 permet le retour de CDK1 à un état actif. CDK1 est successivement associée aux cyclines mitotiques A, B3 et B afin de permettre l’entrée en phase M et la progression de la mitose. La présence des cyclines lors de phase spécifiques du cycle cellulaire est finement régulée. Le complexe ubiquitine ligase SCF est impliqué dans la dégradation de Cycline E. Le complexe APC/C (Anaphase promoting complex/Cyclosome) dégrade les cyclines mitotiques afin de permettre la sortie de mitose. – 11 – Par exemple, au début du développement embryonnaire de la drosophile, la formation des cellules est précédée d’une étape de syncytium, une phase où seuls les noyaux se divisent par une succession de phases S et M sans divisions cellulaires (Lee and Orr-Weaver, 2003).
Contrôle du cycle cellulaire par les complexes Cycline/CDK
La régulation de la progression des différentes phases du cycle cellulaire est assurée par une activation séquentielle de complexes kinase spécifiques composés de deux protéines : une kinase cycline-dépendante (CDK) et une sous-unité activatrice de la famille des cyclines (Lim and Kaldis, 2013). Les CDK sont des sérine-thréonine kinases qui comportent un cœur catalytique, composé d’une poche de liaison de l’ATP, d’un domaine de liaison aux cyclines et d’une boucle T activatrice (Lim and Kaldis, 2013). Les protéines de la famille des cyclines présentent une grande diversité de séquence et de fonction. Elles ont en commun la présence d’un domaine d’une centaine d’acides aminés, la cyclin box, qui est impliqué dans l’interaction avec les CDK (Gopinathan et al., 2011). Chez la drosophile, 13 cyclines ont été identifiées et classées en différents sousgroupes en fonction de leurs similitudes de structure. Les cyclines A, B, D et E sont directement impliquées dans la progression du cycle cellulaire. D’autres cyclines possèdent des rôles indépendants du cycle cellulaire, en association ou non avec des CDK, tels que la régulation de la transcription, la spermatogenèse, le renouvellement des cellules souches ou le métabolisme (Lim and Kaldis, 2013). La Cycline D s’associe à CDK4/6 afin de réguler la progression de la phase G1. L’entrée en phase S requiert la phosphorylation de RBF (Retinoblastoma family protein) par Cycline D/CDK4/6. Cela lève l’inhibition de E2F1, un facteur de transcription dont les gènes cibles (tels que CycE) sont impliqués dans l’entrée en phase S, une étape qui requiert la formation du complexe Cycline E/CDK2. Le complexe Cycline A/CDK2 régule ensuite la progression de la phase S. Enfin, CDK1 est associée successivement aux cyclines A, B3 et B, afin de contrôler l’entrée en phase M (Figure 2).
Régulation de l’activité des complexes Cycline/CDK
L’activation séquentielle des complexes Cycline/CDK, nécessaire à la progression des différentes phases du cycle cellulaire, doit être finement régulée. Un premier niveau de contrôle s’effectue par la régulation de la présence des différentes cyclines lors des phases du cycle cellulaire (Figure 2). Ce contrôle temporel de la présence des cyclines est exercé au niveau transcriptionnel mais également via une dégradation rapide des protéines à des moments précis du cycle cellulaire. En effet, les cyclines doivent leur nom à la variation de leur niveau protéique au cours du cycle cellulaire, puisque les cyclines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire sont produites de façon cyclique au cours de phases spécifiques. Par exemple, les cyclines D et E possèdent une séquence PEST (séquence riche en proline (P), acide glutamique (E), sérine (S) et thréonine (T)) impliquée dans leur dégradation ubiquitine-dépendante. AInsi le complexe SCF (SKP1/Cullin/F-box protein) qui possède une activité ubiquitine ligase, est impliqué dans la dégradation de Cycline E (Moberg et al., 2001). D’autres cyclines, telles que Cycline A et B, présentent des séquences de dégradation nommées « cyclin destruction box » qui sont ubiquitinylées par le complexe APC/C (Anaphase promoting complex/Cyclosome) et permettent ainsi leur dégradation au cours de la mitose (Huang and Raff, 2002). Le niveau de phosphorylation des CDK est également impliqué dans la régulation de l’activité des complexes Cycline/CDK. Par exemple, la phosphorylation de la boucle T par les CDK-activating kinases (CAK) est une étape clé de l’activation des complexes Cycline/CDK chez les levures S. cerevisiae et S. pombe (Pavletich, 1999). A l’inverse, la phosphorylation de résidus du domaine de liaison à l’ATP par les kinases de la famille Wee1 inhibe l’activité enzymatique des CDK (Campbell et al., 1995). La kinase Wee1 inhibe ainsi CDK1 pendant la phase G2. La phosphatase String/Cdc25 permet le retour de CDK1 à un état actif et l’entrée en mitose en retirant ces phosphorylations (Edgar and O’Farrell, 1989). Enfin, la régulation de l’activité des CDK au cours du cycle cellulaire fait également intervenir des inhibiteurs de CDK (CKI). D’une part, les CKI de la famille Cip/Kip inhibent l’activité kinase en s’associant aux complexes Cycline/CDK (Lane et al., 1996; de Nooij et al., 1996). Par exemple, Dacapo/p27 (Dap) est impliquée dans le contrôle de la transition G1/S, – 13 – en inhibant l’activité de Cycline E/CDK2. D’autre part, la CKI Roughex (Rux) empêche l’activation de CDK1 et l’entrée en mitose en interagissant avec Cycline A (Foley et al., 1999). L’ensemble de ces mécanismes de contrôle de l’activité des complexes Cycline/CDK aux différentes phases du cycle cellulaire permet une régulation précise de ce cycle. De plus, ces différents acteurs de la régulation du cycle cellulaire peuvent être mis en jeu afin de moduler la prolifération en réponse à différents signaux. Par exemple, la présence de lésions de l’ADN entraîne un arrêt du cycle cellulaire permettant la réparation des cassures. De manière intéressante, la prolifération cellulaire au sein des disques imaginaux dépend aussi de facteurs qui sont essentiels pour l’organisation de chacun des futurs organes. C’est notamment le cas pour les morphogènes Wg (Wingless) et Dpp (Decapentaplegic) dans le disque imaginal d’aile, dont je traiterai au paragraphe 1.5 de cette introduction. 1.3 Contrôle de la croissance des organes au cours du développement La croissance des organes est finement régulée au cours du développement. En effet, la formation d’un organisme correctement proportionné nécessite une coordination de la croissance des différents organes. De plus, la croissance peut s’adapter aux conditions environnementales telles que l’abondance de nutriments. Je décrirai ici certains mécanismes impliqués dans cette régulation : la régulation de la croissance cellulaire par le proto-oncogène Myc, le contrôle de la croissance et du métabolisme par la voie Insuline/TOR et le rôle de la voie Hippo dans la taille finale des organes.
Implication de Myc dans le contrôle de la croissance cellulaire
L’augmentation de la taille des organes requiert une augmentation du nombre de cellules, mais également une augmentation de la masse des cellules. Cette croissance cellulaire nécessite une régulation de la synthèse protéique et du métabolisme des cellules. Un facteur clé dans la régulation de la croissance cellulaire est la protéine Myc, qualifiée de proto-oncogène en raison de sa surexpression dans de nombreux types de cancers. Chez la drosophile, elle est codée par le gène dm (diminutive) porté par le chromosome X (Gallant, 2006). Les femelles adultes homozygotes pour dmP0 , un allèle hypomorphe faible de dm, présentent une taille réduite mais sont correctement proportionnées. Elles ont également un retard de développement, et des soies courtes et fines. Ce faisceau de phénotypes est similaire au phénotype « Minute » (Morata and Ripoll, 1975), induit par les mutations de gènes codant des protéines ribosomiques, qui ralentissent le développement en raison d’une diminution de la synthèse protéique (Marygold et al., 2007). Les cellules du disque d’aile de mouches mutantes pour dm présentent une croissance cellulaire réduite, détectable par une diminution de taille des cellules tout au long du développement (Johnston et al., 1999). A l’inverse, la surexpression de dm induit une augmentation de la croissance cellulaire et une accélération de la phase G1, qui n’affecte cependant pas la prolifération cellulaire puisqu’elle est compensée par un allongement de la phase G2 (Johnston et al., 1999). Cela aboutit à une augmentation de la taille des cellules, et à des mouches adultes présentant une augmentation de taille de 30% (la Cova et al., 2004). Myc est impliquée dans la régulation de la croissance des tissus, de la prolifération et de l’apoptose. Elle forme avec la protéine Max des hétérodimères qui activent la transcription de leurs gènes cible. A l’inverse, lorsque Max interagit avec Mad/Mnt, elle exerce un rôle de répresseur au niveau des mêmes cibles, s’opposant ainsi à la fonction de Myc. L’analyse des sites de fixation de Myc:Max et l’étude du transcriptome de cellules dans lesquelles dm est dérégulé montrent qu’un grand nombre des cibles transcriptionnelles de Myc sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes, la traduction et la régulation du métabolisme (Orian et al., 2003; Hulf et al., 2005; Grewal et al., 2005).
Régulation de la croissance des organes par la voie Insuline/TOR
La perception de l’abondance de nutriments dans l’environnement est essentielle pour adapter la croissance de l’organisme aux ressources disponibles. De plus, chez les organismes pluricellulaires, la croissance de chaque cellule doit être coordonnée avec celle des cellules du même tissu, et en adéquation avec la croissance du reste de l’organisme, – 15 – grâce à une régulation systémique. Ces deux niveaux de régulation de la croissance des organes font intervenir les voies hautement conservées InR (Insulin Receptor) et TOR (Target of rapamycin) (Oldham and Hafen, 2003; Grewal, 2009) (Figure 3). Les mutations affectant la voie TOR chez la drosophile induisent des phénotypes similaires à ceux observés dans des conditions de privation de nourriture, à savoir une taille réduite de l’organisme due à une diminution du nombre et de la taille des cellules. C’est le cas notamment d’allèles hypomorphes de Tor et de s6k (ribosomal protein S6 kinase), une cible de la voie TOR (Oldham et al., 2000; Montagne et al., 1999). La kinase TOR contrôle de façon autonome cellulaire de nombreux processus limitants pour la division et la croissance cellulaire. Par exemple, TOR régule positivement la biogenèse des ribosomes, en favorisant l’activité de TIF-IA (transcription initiation factor IA), impliquée dans la synthèse des ARN ribosomiques (Grewal et al., 2007) et de S6K (ribosomal protein S6 kinase) (Grewal, 2009). D’autre part, TOR favorise l’initiation de la traduction en régulant négativement 4E-BP/Thor (eukaryotic Initiation Factor 4E (eIF4E)-binding protein), un inhibiteur de l’initiateur de la traduction eIF4E (Hietakangas and Cohen, 2009). La voie TOR peut être activée en réponse à l’abondance de nutriments, en fonction du statut énergétique de la cellule, ou encore par la voie du récepteur de l’insuline (InR) (De Virgilio and Loewith, 2006). La voie InR régule la croissance et le métabolisme en fonction de l’état nutritionnel de l’organisme (Figure 3). Chez la drosophile, le récepteur de l’insuline est activé par liaison des ILP (insulin-like peptides) circulants, qui sont les orthologues structurels et fonctionnels de l’insuline et des IGF (insulin growth factor) de mammifère (Brogiolo et al., 2001). L’activation de InR permet le recrutement de la protéine adaptatrice Chico/IRS (insulin receptor substrate) et l’activation de la voie PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt (également appelée PKB pour Protéine kinase B) (Grewal, 2009). Une des cibles de cette voie est le facteur de transcription FOXO (Forkhead box class O) dont la phosphorylation par Akt empêche la localisation nucléaire et l’activité transcriptionnelle (Burgering, 2008). Les facteurs de transcription de la famille FOXO sont conservés au cours de l’évolution, et ils sont impliqués dans la régulation négative de la croissance, de la prolifération et de la survie cellulaire, et dans la résistance au stress. Chez D. melanogaster, FOXO promeut notamment la transcription de 4E-BP (Jünger et al., 2003; Puig et al., 2003), et réprime les gènes dm et dilp2 (Puig and Mattila, 2010). – 16 – Figure 3. La voie Insuline/TOR A gauche : La voie de l’insuline/TOR (Target of Rapamycin) agit sur des régulateurs de la synthèse protéique tels que Myc et l’inhibiteur de traduction 4E-BP (eukaryotic Initiation Factor 4E-binding protein). L’activation du récepteur de l’insuline (InR) par la fixation des ILP (Insulin-like peptides) mène à l’activation de la kinase AKT par PI3K (phosphatidyl-inositol 3 kinase). AKT inhibe le facteur de transcription FOXO, qui régule négativement la croissance, notamment via la répression de dm et l’activation de 4E-BP. AKT a aussi pour cible le complexe TSC1/2 (tuberous sclerosis complex 1/2) qui inhibe le régulateur métabolique TOR. L’activité de TOR est également modulée en réponse à la présence de nutriments. TOR promeut la biogenèse des ribosomes en activant Myc et TIF-IA (transcription initiator IA), qui sont impliquées dans la synthèse des protéines et ARN ribosomiques. TOR favorise également la synthèse protéique en réprimant 4E-BP. A droite : La voie Insuline/TOR s’oppose dans la régulation de Myc à la voie Hippo, une voie qui régule négativement la croissance. (Adapté de Vincent et al., 2013)
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