Efficacité comparée des extraits de quelques plantes médicinales sur une espèce de moustique Culex pipiens

Présentation de l’espèce de plantes étudiées 

Rosmarinus officinalis (Linné 1753) Rosmarinus officinalis L. ou romarin, et encore Klil, en arabe (Quezel & Santa, 1963) est originaire des pays tempérés de la région méditerranéenne (Andrade et al, 2018). Le Romarin est une plante aromatique, médicinale et condimentaire appartenant à la famille des Lamiacées. Il est largement distribué en Europe, en Asie et en Afrique et notamment en bassin Méditerranée (Kasparavicienė et al., 2013). Le Romarin fait partie des espèces végétales les répandus en Algérie où il se présente à l’état sauvage dans les zones littorales, les lieux sec et arides même au Sahara (Yazina, 2010). Il se développe bien dans les collines et les basses montagnes, sur les sols calcaires, schisteux, argileux et rocheux (Hameed, 2017). Quezel & Santa (1963) décrivaient le romarin en tant qu’un arbrisseau ligneux très odorant. Les feuilles linéaires entières à marges révolutéeslongues de 1-2 cm, verdâtres en dessus, hispides blanchâtres en dessous. 7 Selon Begum et al. (2013), la systématique botanique de la plante Rosmarinus officinalis proposé par Linné (1753) est comme suit : Règne Plantae Sous règne Tracheobionta Embranchement Spermatophyta Sous embranchement Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Sous classe Asteridae Ordre Lamiales Famille Lamiaceae Genre Rosmarinus Espèce Rosmarinus officinalis (Linné, 1753) 

Artemisia campestris (Linné, 1753)

Artemisia est un genre de petites herbes et arbustes appartenant la famille des Asteraceae qui comprend environ 1 000 genres et plus de 20 000 espèces (Abadet al., 2012). C’est un genre cosmopolite principalement répartie dans les zones tempérées de l’hémisphère nord en Asie, Amérique du nord, Europe et l’Afrique du Nord (Bakchiche et al.,2019) colonisant des environnements arides et semi-arides (steppes) (Janaćković, et al., 2019). Artemisia campestris communément appelées « Degoufet » est un arbuste pérenne faiblement aromatique atteignant 30-150 cm, à rameaux constituant une panicule. Les Tiges sont ligneuses à la base et striées. Les feuilles sont glabres de couleur vert foncé. C’est plante commune des Hauts-Plateaux, rare l’Atlas Saharien et très rare dans le Sahara Septentrional. Selon Dib & El Alaoui-Faris (2019) et Quezel & Santa(1963), la systématique de la plante Artemisia compestris proposée par (Linné 1753) est comme suit : Règne Plantae Sous règne Tracheobionta Embranchement Spermatophyta Sous embranchement Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Sous classe Asteridae Ordre Asterales Famille Astéracées Sous famille Asteroideae Tribu Anthemideae Genre Artemisia Espèce Artemisia campestris (Linné, 1753) 

Origine géographique des espèces de plantes

Les échantillons de la plante Rosmarinus officinalis (Fig.2) ont été collectés en mois d’Octobre 2015 et janvier 2016 à partir d’un site dans la commune de BirEdheb dans la wilaya de Tébessa (Fig. 3). La plante Artemisia campestris (Fig.2) a été collectée au mois d’Octobre 2015 au stade de floraison, dans la commune de Hammamet à la wilaya de Tébessa (Fig.3). L’identification botanique des plantesa été réalisée au niveau du département de Biologie des êtres vivants, à l’Université Larbi Tebessi, par Mme Hioun Soraya (Maître assistant). Les plantesont été rincées et séchées à l’ombre pendant quinze jours, puis pesées et récupérées dans des sacs en papier afin de les conserver jusqu’au moment de l’expérience. Figure 2. Spécimens des plantes étudiées : à gauche Rosmarinus officinalis ;à droite Artemisia campestris (photos personnelles). 9 Figure 3. Localisation géographique de la zone de collecte des plantes. En vert :A. Rosmarinus officinalis (Bir Edheb). B.Artemisia campestris (Hammamet). En rouge : sites de collectes de moustiques

Extraction des huiles essentielles

Notre étude porte sur les parties aériennes de Rosmarinus officinalis et d’Artemisia campestris (Tiges et feuilles). L’extraction des huile essentielles a été effectuée par hydrodistillation, dans un appareil de type Clevenger (Fig.4). Une biomasse de la plante sèche avec un volume d’eau distillée sont mis dans un ballon, l’ensemble est porté à ébullition. Les vapeurs chargées d’huile essentielle, traversant un réfrigérant, se condensent et chutent dans une ampoule à décanter, l’eau et l’huile se séparent par différence de densité. Ensuite, l’huile estrécupérée dans de petits flacons opaques et stockée à 4°C. Le rendement en huile essentielle est le rapport entre le poids de l’huile extraite et le poids de la matière sèche de la plante (AFNOR, 1986). Il est exprimé en pourcentage et calculé selon la formule suivante : Ou R : Rendement en huile en %. PA : Poids de la matière sèche de la plante en g. PB : Poids de l’huile en g. R = PB / PA × 100 10 Figure 4. Montage de l’hydrodistillateur de type Clevenger (Photos personnelles).

Extraction par les solvants

Extraction par les solvants de polarité croissante

L’extraction par les solvants de polarité croissante (Fig. 5) a été effectuée par macération en utilisant quatre solvants de polarité croissante successivement. Les macéras sont réunis puis ils ont été filtrés via un entonnoir pourvu du coton. Les filtrats sont évaporés presque à sec au moyen d’un évaporateur rotatif. Cette série d’extraction a permis d’obtenir 4 extraits organiques bruts : Ether de pétrole (EP), Dichlorométhane (DM), Acétate d’éthyle (AE), Méthanol (ME) et un extrait acqueux : l’eau distillée (ED). Les cinq extraits sont placés dans l’étuve pour être séchés. Les extraits secs sans solvant ont été pesés puis stockés dans des flacons stériles en verre jusqu’à leur utilisation. 11 Figure 5. Procédé d’extraction par des solvants de polarité croissante (Photos personnelles). 1. Macération dans le solvant. 2. Filtration des macéras. 3. Récupération des filtrats. 4. Evaporation par rotavapeur. 5. Séchage à l’étuve.

Extraction par un solvant hydroalcoolique

La méthode d’extraction adoptée est la macération successive par un solvant hydroalcoolique. Une quantité de la plante est macéré avec le solvant à une température ambiante dans un Ernlenmeyer fermé hermétiquement par parafilm. Le contenu subit une filtration par décantation dans un entonnoir munit du coton hydrophile. Une fois le filtrat est récupéré, il subit encore autres extractions comme illustré dans la figure 6. Ces filtrats sont additionnés et concentrés à sec par un évaporateur rotatif. Après évaporation, l’extrait obtenu est placé à l’étuve pour éliminer le solvant et sécher l’extrait. Finalement la quantité d’extrait obtenue est pesée dans une balance de précision pour le calcul du rendement. Le rendement de l’HE et des extraits est défini comme étant le rapport entre la masse obtenue et la masse du matériel végétal traité (AFNOR, 1986). R % = PB / PA × 100 P A : Poids de la matière sèche de la plante en g. PB : Poids de l’extrait en g. 1 2 3 4 5 12 Figure 6. Schéma représentant le processus de l’extraction hydroalcoolique. 

Analyse chimique des huiles essentielles par CPG-SM 

Huile de R. officinalis

L’analyse chimique de l’HE de R. officinalis a été réalisée au centre de recherche scientifique et technique en analyses physicochimique CRAPC (Tipaza, Algérie) par chromatographie en phase gazeuse (GC/FID) et chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (CPG/SM). L’HE a été analysée sur un chromatographe en phase gazeuse HewlettPackard (HP) 6890 plus (Agilent Technologies) équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (FID) couplé à un spectromètre de masse quadripolaire Hewlett-Packard (HP) 5973 (Agilent Technologies). La séparation a été réalisée en utilisant une colonne capillaire non polaire HP5MS (5% phényl 95% méthylpolysiloxane) (longueur de 30m x diamètre interne de 0,25 mm et épaisseur de film 0,25 mm). La température du four a été maintenue à 60 ° C pendant 8 min, puis programmée à la vitesse de 2° C/ min à 250 °C. Le gaz vecteur qui constitue la phase mobile est l’Hélium, réglé à un débit de 0,5 ml/min. L’échantillon (0,2 μL) a été injecté avec un ratio de 50:1. L’injecteur a été maintenu à une température de 250 °C. Le spectromètre de masse fonctionnait en mode impact électronique à 70 eV. Les températures de la source d’ions et de l’interface étaient de 230 °C et 270 °C, respectivement. L’identification des composés individuels a été réalisée sur la base d’indices de rétention en utilisant une série homologue de n-alcanes (C4-C24, Sigma-Aldrich), par comparaison de leurs spectres de masse avec ceux enregistrés dans les bibliothèques de spectres de masse (Wiley 7n.L, NIST02. L). Les pourcentages relatifs des composants individuels ont été calculés sur la base de la surface du pic GC (réponse FID) obtenue sans correction du facteur de réponse. La quantification a été effectuée par la méthode standard externe. Des courbes d’étalonnage de composés représentatifs de chaque classe ont été dessinées et utilisées pour la quantification. 

Huile d’A.campestris

L’analyse chimique de l’HE d’A.campestris a été effectuée au département de Chimie à la Faculté des Sciences, Université Sitki Kocman (Mugla, Turquie). Elle a été réalisée en utilisant un chromatographe en phase gazeuse Shimadzu GC-17 AAF, V3, LV Series (Kyoto, Japan), équipé d’un FID et d’une colonne capillaire DB-5 (longueur 30m × diamètre interne 0,32 mm, épaisseur du film 0,32 µm). La température du four a été maintenue à 60°C pendant 5 min, puis programmée à 240°C à 4°C/min et maintenue isotherme pendant 10 min. Les températures de l’injecteur et du détecteur étaient respectivement de 250°C et 270°C. Le gaz vecteur était de l’hélium à un débit de 1,3 ml/min. Le volume d’injection était de 1 μLet le ratio de division était 14 de 50:1. La composition en pourcentage d’HE d’A.campestrisa été déterminée avec un programme informatique Class-GC 10. L’analyse de l’HE par CPG-SM a été réalisée en utilisant une trappe ionique Varian Saturn 2100 (Old York Rd., Ringoes, NJ, USA), équipée d’une colonne capillaire apolaire DB-5 MS (30 mx 0,32 mm, épaisseur de film 0,32 μm). Le gaz vecteur était de l’hélium à un débit de 1,4 ml/min. La température du four a été maintenue à 60°C pendant 5 min, puis augmentée jusqu’à 240 ° C avec des incréments de 4°C/min et maintenue à cette température pendant 10 min. Les températures de l’injecteur et de la ligne de transfert ont été fixées à 250 et 180°C, respectivement. La température du piège à ions était de 200°C. Le volume d’injection était de 0,2 μL et le split ratio était de 1:30. Les mesures EI-MS ont été effectuées à une énergie d’ionisation de 70 eV. L’identification des composants de l’HEd’A.campestrisétait basée sur les indices de rétention GC et la correspondance avec la base Wiley, NIST-2005 et TRLIB, ainsi que par comparaison des spectres de masse avec ceux rapportés dans la littérature (Adams, 2007) et, par co-injection avec des composés authentiques. 2.8. Essais toxicologiques L’activité larvicide déterminée à travers les tests de toxicités a été évaluée selon le protocole standard de l’organisation mondiale de la santé (OMS, 2005). Une solution mère d’huile essentielle a été préparée, puis diluée pour obtenir des concentrations finales. Des lots de larves de quatrième stade nouvellement exuviées de Cx.pipiens ont été placés dans des gobelets en plastique contenant d’eau déchlorurée et un volume de concentration préparée. Par ailleurs, une série témoin négatif et une série témoin positif est conduite en parallèle (Fig. 7). Après 24 heures d’exposition, les larves ont été retirées et placées dans l’eau propre. Cinq répétitions ont été réalisées pour chaque concentration ainsi que pour les témoins. Les mortalités sont été enregistrées à 24, 48 et 72 heures après traitement. Le pourcentage de mortalité observée est corrigé par la formule d’Abbott (1925) qui permet d’éliminer la mortalité naturelle et déterminer la toxicité réelle de l’extrait. Grâce à un logiciel Graph Pad Prism 7, les concentrations létales ont été déterminées et seront appliquées sur les larves L4 de Cx. pipiens pour étudier leurs effets sur la morphométrie, la composition biochimique et les biomarqueurs.