EG-VEGF, nouvel acteur du développement placentaire

Acteurs principaux de l’angiogenèse

Le développement des organes et la régénération tissulaire chez les mammifères sont sous le contrôle de signaux de communication cellulaire impliquant particulièrement les facteurs de croissances. Parmi les cytokines impliquées dans la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et dans l’assemblage correct de la paroi vasculaire, on trouve la famille des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), des Fibroblast Growth Factor (FGF), Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), des Angiopoïétines (Ang) et les Transforming Growth Factor-β (TGF-β). Parmi les divers facteurs angiogeniques, la famille la plus étudiée est celle des VEGF, qui a pour cible principale les cellules endothéliales. a) La famille des VEGFs La famille des VEGFs, qui sont des facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire, est composée de cinq membres chez les mammifères : VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, et PlGF (Placental Growth Factor) (voir figure 29). Les homologues de VEGF produits par les virus Orf sont appelés VEGF-E, tandis qu’un autre homologue isolé du venin de serpent est dénommé VEGF-F. Ces facteurs se lient à trois récepteurs différents appelés VEGFR-1 (flt1), VEGFR-2 (flk-1 ou KDR) et VEGFR-3 (flt-4). Ils peuvent également se fixer à des corécepteurs appelés neuropiline-1 (NRP1) et neuropiline-2 (NRP2) et aux protéoglycanes à sulfate d’héparane10 (HSPG) dont font partie l’héparine11 et les héparanes sulfates12 (Cross M. J. et al. 2003, Neufeld et al. 1999). Les protéines VEGFs possèdent toutes un motif extrêmement conservé composé de 8 cystéines. Ce motif est impliqué dans des ponts disulfures intra ou inter-moléculaires qui permettent la formation des dimères de VEGF biologiquement actifs (Potgens et al. 1994). Les protéines VEGFs sont glycosylées et sécrétées (Salven et al. 1998).  VEGF-A Il est décrit comme un facteur clé du processus d’angiogenèse. Initialement, le VEGF-A a été mis en évidence comme étant un facteur de perméabilité vasculaire sécrété par les cellules tumorales (Senger et al. 1986), ce qui lui a valu son autre appellation de Vascular  glycosaminoglycane et composant de la matrice extracellulaire. 12 glycosaminoglycanes qui sont exprimés à la surface de la plupart des cellules et fixe de nombreuses protéines. Introduction 30 Permeability Factor (VPF) (Senger et al. 1983). En 1989, d’autres groupes ont identifié un facteur de croissance sécrété capable d’induire la prolifération spécifique des cellules endothéliales, ils le nommèrent Vasculotropine (Plouet et al. 1989) et VEGF (Ferrara and Henzel 1989). Ce facteur de croissance présente une activité angiogène importante (Leung et al. 1989) et s’est révélé être identique au VPF (Keck et al. 1989). Le clonage de la Vasculotropine et du VEGF démontra que ces deux protéines étaient identiques. Le VEGF est fortement conservé entre les espèces. Il existe plusieurs isoformes de VEGF-A produites par épissage alternatif (VEGF121, 145, 165, 183, 189, 206), la plus abondante et la plus étudiée étant celle constituée de 165 acides aminés. Ces isoformes diffèrent dans leur partie Cterminale, ce qui leurs confère des affinités différentes pour les héparanes sulfates de la membrane basale, et joue sur leur distribution dans les tissus (Houck et al. 1992, Park et al. 1993). Les effets du VEGF-A sont modulés selon l’isoforme concerné. La sécrétion du VEGF-A est stimulée en réponse à l’hypoxie (Liu et al. 1995, Wang et al. 1995). VEGF-A tient un rôle central dans la phase d’activation de l’angiogenèse. En effet, il augmente la perméabilité des cellules endothéliales (Esser et al. 1998, Kevil et al. 1998, Kohn et al. 1992, Senger et al. 1983), stimule leur prolifération (Connolly et al. 1989, Ferrara and Henzel 1989, Gospodarowicz et al. 1989), leur migration (Dimmeler et al. 2000), et inhibe leur apoptose (Gerber et al. 1998). L’importance de VEGF-A dans l’angiogenèse a été montrée dans divers modèles expérimentaux in vivo. Chez la souris, l’inactivation d’un seul allèle du gène de VEGF-A conduit à une mort embryonnaire à E11-12 avec des défauts précoces de la vascularisation embryonnaire et du sac vitellin (Carmeliet et al. 1996, Ferrara et al. 1996). Le VEGF-A se lie avec une forte affinité sur ses deux récepteurs, le VEGFR-1 (flt-1) et le VEGFR-2 (flk-1, KDR) (de Vries et al. 1992, Terman et al. 1992). Les souris knock-out pour ces deux récepteurs meurent tôt au cours du développement embryonnaire à E8.5 et E9.5 à cause de défauts majeurs du développement des réseaux vasculaires vitellins et embryonnaires. En revanche, le VEGF-A ne montre pas d’affinité pour le VEGFR-3 (Shibuya and Claesson-Welsh 2006). Des nouvelles isoformes du VEGF-A ont été mises en évidence récemment et sont appelées isoformes b. Elles diffèrent dans les 6 derniers acides aminés de leur région C-terminale (Bates et al. 2002). Le VEGF165b est la première isoforme b à avoir été identifiée, puis d’autres ont également été décrites (Miller-Kasprzak and Jagodzinski 2008, Perrin et al. 2005). Ces isoformes ont été rapportées pour avoir des effets antiangiogeniques (Konopatskaya et al. 2006, Woolard et al. 2004). Introduction 31  VEGF-B Le VEGF-B a été isolé à partir d’une banque d’ADN complémentaire issus de cœur de souris adultes et de cellules d’un fibrosarcome humain. Il se lie uniquement au VEGFR-1. Il est capable de former des hétérodimères avec le VEGF-A, qui lie le VEGFR-2. Il est mitogène pour les cellules endothéliales (Olofsson et al. 1996). Les souris déficientes en VEGF-B apparaissent normales à la naissance, mais présentent des anomalies dans le développement cardiaque post-natal. La mesure du flux coronarien suite à une ischémie/reperfusion montre que ces souris présentent des altérations dans la réponse physiologique à une ischémie cardiaque (Bellomo et al. 2000).  Le VEGF-C Isolé à partir de milieu de culture de cellules de carcinome de la prostate, c’est le premier ligand caractérisé de VEGFR-3 (Lee J. et al. 1996). Seule la forme mature peut se lier également au VEGFR-2 (Joukov et al. 1997). L’analyse du patron d’expression de VEGF-C et du VEGFR-3 (Kukk et al. 1996), ainsi que l’hyperplasie des vaisseaux lymphatiques engendrée par la surexpression de VEGF-C in vivo (Jeltsch et al. 1997), suggèrent un rôle important de ces molécules dans le développement des vaisseaux lymphatiques, ainsi qu’une forte implication dans la lymphangiogenèse tumorale et la dissémination des métastases (Pepper et al. 2003).  Le VEGF-D C’est le second ligand identifié de VEGFR-3. Ce facteur de croissance présente de fortes homologies structurelles et fonctionnelles avec le VEGF-C et constitue, avec celui-ci, une sous-classe dans la famille des VEGFs impliquée dans la régulation de la lymphangiogenèse (Achen et al. 1998). Leurs interventions au cours de l’angiogenèse par leur capacité à induire l’autophosphorylation de VEGFR-2 reste à établir (Byzova et al. 2002, Jeltsch et al. 1997).  Le VEGF-E Il a été cloné à partir du génome du parapoxvirus Orf et induit spécifiquement l’autophosphorylation de VEGFR-2 et non de VEGFR-1 (Meyer et al. 1999).  Le PlGF Le PlGF a été isolé à partir d’une banque d’ADN complémentaire de placenta humain, et présente une activité mitogène pour les cellules endothéliales (Maglione et al. 1991). Introduction 32 Le gène plgf, situé sur le chromosome 14, produit quatre isoformes, PlGF-1, PlGF-2, PlGF-3 et PlGF-4. PlGF se lie à VEGFR-1, à NRP-1 et NRP-2 (Adini et al. 2002, Persico et al. 1999). PlGF-1 et PlGF-2 sont capables de lier le VEGFR-1 (soluble ou non soluble) sous leur forme homodimérique PlGF/PlGF ou hétérodimérique PlGF/VEGF, formes qui ne sont pas nécessairement fonctionnelles (Eriksson et al. 2002). La possibilité de formation d’hétérodimères avec le VEGF peut constituer un niveau de régulation supplémentaire de l’activité biologique du VEGF, en forçant la formation du complexe de signalisation VEGF/VEGFR-2 (De Falco et al. 2002). PlGF stimule la prolifération, la migration et la survie des cellules endothéliales (Adini et al. 2002, Carmeliet et al. 2001, Fischer et al. 2007, Ziche et al. 1997). Il augmente également la prolifération des fibroblastes et des cellules de muscle lisse (Bellik et al. 2005). Il stimule l’angiogenèse et le recrutement de progéniteurs myéloïdes (Hattori et al. 2002, Luttun et al. 2002, Rafii et al. 2003). Récemment, l’implication de PlGF dans l’artériogenèse via son action sur l’activité des monocytes a été mise en évidence (Pipp et al. 2003). Contrairement au VEGF, il n’est capable de se lier qu’au VEGFR-1 (Park et al. 1994). b) Les autres facteurs Parmi les facteurs impliqués dans l’angiogenèse, on trouve également la famille des Fibroblast Growth Factor (FGF), Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), des Angiopoïétines (Ang) et les Transforming Growth Factor-β (TGF-β).  Les FGFs La famille des FGFs chez les mammifères se compose de 18 membres. FGF-1 et FGF-2 (ou bFGF pour basic Fibroblast Growth Factor) ont une séquence identique de 120 acides aminés environ, qui leur donne la capacité de lier l’héparine ou les HSPGs. Ces HSPGs sont indispensables pour les liaisons avec les récepteurs FGFRs. Les récepteurs aux FGFs possèdent une activité tyrosine kinase et sont au nombre de 4 : FGFR-1, FGFR-2, FGFR-3, et FGFR-4. Le FGF-2 est le premier facteur de croissance identifié possédant une activité angiogène (Ferrara 2002). Ce facteur paraît important au cours de l’angiogenèse par sa capacité à favoriser la prolifération, la migration et l’organisation tubulaire des cellules endothéliales, ainsi qu’à induire l’angiogenèse in vitro (Montesano et al. 1986). Il est aussi, du moins en partie, responsable de la libération de protéases susceptibles de dégrader la membrane basale, permettant ainsi la pénétration des cellules endothéliales vers l’espace périvasculaire (Mignatti et al. 1991). Introduction 33  Les PDGFs Le PDGF fut initialement purifié à partir de plaquettes (Antoniades et al. 1979). Il existe 4 formes de ce facteur, codées par quatre gènes (pdgf-a à d). Ces facteurs sont fonctionnels sous formes dimériques (homo ou hétérodimères), et ont des séquences proches de celle du VEGF (Andrae et al. 2008). Les PDGFs stimulent la prolifération des cellules de muscle lisse et des péricytes (D’Amore and Smith 1993), et augmentent la stabilité de la paroi vasculaire, en attirant et en intégrant ces cellules murales aux néo-vaisseaux (Hellstrom et al. 1999, Lindahl et al. 1997).  Les Angiopoïétines Les angiopoïétines tiennent un rôle primordial dans l’angiogenèse, et plus particulièrement dans la phase d’activation et dans la phase de maturation. Il existe 4 angiopoïétines (Ang-1 à 4) et 2 récepteurs (Tie-1 et Tie-2) (Gale and Yancopoulos 1999, Runting et al. 1993, Sato T. N. et al. 1993). Les récepteurs sont exprimés par les cellules endothéliales et hématopoïétiques (Sato T. N. et al. 1993). Ang-1, qui a été identifié comme agoniste du récepteur Tie-2 (Davis S. et al. 1996), induit l’autophosphorylation de Tie-2, ce qui déclenche alors la phosphorylation de la protéine kinase Akt, protéine reconnue pour induire la survie et la quiescence des cellules endothéliales (Fiedler and Augustin 2006). Quant à Ang-2, il a été décrit comme un antagoniste du récepteur Tie-2, ce qui a pour effet de bloquer la signalisation d’Ang-1 via Tie-2, et d’induire un relâchement des jonctions intercellulaires (Maisonpierre et al. 1997). Lors de la phase de maturation, l’arrêt de la sécrétion d’Ang-2 permet le rétablissement de la voie Ang-1/Tie-2, et ainsi l’induction du resserrement des jonctions intercellulaires et la quiescence de l’endothélium (Thurston et al. 2000).  Les TGF-β La superfamille du TGF-β comprend un nombre important de facteurs de croissance structurellement reliés. La famille des isoformes du TGF-β comporte 5 membres, dont 3 chez les mammifères. TGF-β1 fut le premier membre de cette superfamille cloné (Derynck et al. 1985), puis TGF-β2 (de Martin et al. 1987, Madisen et al. 1988), et enfin TGF-β3 (ten Dijke et al. 1988). La superfamille du TGF-β régule une multitude de processus dont la prolifération, la différenciation, la mobilité, l’adhésion et la mort cellulaire. Les membres de la famille TGF-β signalisent via un complexe hétéromérique de récepteurs transmembranaires de type I et de type II à activité sérine/thréonine kinase.

L’hypoxie et HIF L’hypoxie correspond à la diminution de la pression partielle en oxygène

La réponse cellulaire à ce stress fait intervenir principalement le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxiainducible factor-1), qui active de nombreux gènes importants pour l’adaptation et la survie cellulaire et tissulaire. Les facteurs de transcription HIFs sont des hétérodimères formés d’une sous-unité nucléaire HIF-1β, exprimée de manière constitutive et ubiquitaire, et d’une sousunité inductible α (Chen L. et al. 2009, Lee J. W. et al. 2004). Il existe trois isoformes α : HIF1α, HIF-2α et HIF-3α. HIF-1α est exprimé de façon ubiquitaire, HIF-2α et HIF-3α le sont de manière plus restrictive (Chen L. et al. 2009). HIF-1α et HIF-1β sont des protéines de 826 et 789 acides aminés, respectivement. Ces deux protéines contiennent une séquence de localisation nucléaire et un domaine bHLH (hélice boucle hélice basique). La région basique de ce domaine est essentielle à la fixation à l’ADN, alors que la région HLH est indispensable à la dimérisation de ces facteurs (Dunwoodie 2009). HIF-1α possède un domaine de dégradation dépendant de l’oxygène (ODD) permettant sa protéolyse en normoxie (voir figure 30). Le facteur de transcription HIF-1 est situé à un carrefour de différentes voies de signalisation cellulaire. Son activité est régulée par un grand nombre de mécanismes et notamment par des modifications covalentes.  Régulation de HIF-1 dépendante de l’hypoxie L’activité des facteurs HIFs est majoritairement régulée au niveau post-traductionnel. L’expression du gène et la traduction de HIF-1α sont constitutives. En revanche, cette protéine est extrêmement labile, et sa demi-vie est de moins de 5 minutes en normoxie (Jewell et al. 2001). – En condition « normoxique » (c’est-à-dire supérieur à 5%) HIF-1α est hydroxylée sur les résidus proline 402 et 564 par trois hydroxylases dépendantes de l’oxygène (PHD1 à PHD3) possédant des activités biologiques distinctes (Schofield and Ratcliffe 2004). Une fois hydroxylée, HIF-1α est reconnue par la protéine suppresseur de Introduction 35 tumeur VHL (Von Hippel Lindau), qui est un composant du complexe ubiquitine ligase E3 (Ivan et al. 2001, Jaakkola et al. 2001, Kaelin 2002). Cette reconnaissance va entraîner l’ubiquitinilation d’HIF-1α, et son adressage au protéasome pour être dégradée. La présence d’oxygène est indispensable à l’activité des PHDs. L’inactivation de la PHD-2 est suffisante à la stabilisation de HIF-1α. De plus, les PHD-2 et PHD-3 sont induites en hypoxie sous la dépendance de HIF, ce qui constitue un rétrocontrôle négatif de ce système (Berra et al. 2003). En condition de normoxie, l’acétylation de la lysine 532 de HIF-1α conduit également à sa dégradation après interaction avec la protéine VHL (Jeong et al. 2002). D’autres facteurs protéiques interviennent dans le contrôle de l’activité de HIF-1 en condition de normoxie comme le Factor Inhibiting HIF-1 (FIH-1) et le p300/CBP interacting transactivator ED-rich tail 2 (CITED2) (Dunwoodie 2009). – En condition hypoxique Les différentes hydroxylations de HIF-1α sont bloquées et son acétylation inhibée, ce qui permet sa stabilisation et son hétérodimérisation avec HIF-1β pour former le facteur de transcription HIF-1 actif. Ce facteur se fixe sur les séquences HRE (hypoxia response element) présentes sur les promoteurs des gènes cibles (Semenza 2003). La stabilisation de HIF-1 est détectable pour des teneurs en oxygène inférieures à 5 %, et allant jusqu’à l’anoxie. Dans ces conditions, l’activité des PHDs diminue en fonction de la concentration en oxygène qui est un de leurs substrats. En dessous de 1,5 % d’oxygène, ces enzymes sont inhibées par des radicaux libres oxygénés (ROS) de type H2O2, ce qui contribue au blocage efficace de leurs activités (Brunelle et al. 2005; Guzy et al. 2005; Mansfield et al. 2005).  Régulation de HIF-1 indépendante de l’hypoxie Des stimulations cellulaires par des facteurs de croissance (Feldser et al. 1999; Richard et al. 2000), des cytokines (Hellwig-Burgel et al. 1999) et des hormones (Richard et al. 2000; Gorlach et al. 2001) peuvent également conduire à une induction et une activation de HIF-1α. Beaucoup de ces facteurs sont augmentés pendant la grossesse, comme l’Angiotensine II (Irani and Xia 2008) ou le TGF-β3 par exemple (Caniggia et al. 1999), et agissent ainsi sur le développement placentaire. Contrairement aux effets observés en hypoxie, l’activation de HIF est alors le résultat d’une augmentation de sa traduction, qui est alors plus importante que sa dégradation.