ETUDE DE L’ACTIVITE ANTI-DIARRHEIQUE DE L’EXTRAIT RSN16 CHEZ LE COBAYE

Etude de l’activité de l’extrait RSN16 sur la motilité intestinale

L’activité de l’extrait RSN16 sur la motilité intestinale a été étudiée in vitro par son effet sur la contraction provoquée par l’acétylcholine (BRYCE J. et coll., 2005 ; FLEER H. et VERPOHL E. J., 2007). L’iléon de cobaye isolé a été utilisé dans ce test. Pour isoler cet organe, le cobaye a été sacrifié et exsanguiné en coupant les deux carotides. Ensuite, une laparotomie a été effectuée, puis l’iléon a été prélevé et placé dans un récipient contenant une solution de Tyrode aérée avec un aérateur. Les mésentères ont été enlevés et une fois débarrassé de ces tissus, l’iléon isolé a été découpé en morceaux de 1 cm de longueur pour son montage dans une cuve à organe isolé contenant une solution de Tyrode maintenue à la température de 37°C et aérée à l’aide d’un aérateur. La composition de la solution de Tyrode exprimée en mM a été la suivante : Na Cl : 136,75, KCl : 3,60, MgSO4 : 1,06, NaH2PO4 : 0,42, NaHCO3 : 11,90, CaCl2 : 1,8, glucose : 1 et eau distillée : 1 litre (VAN ROSSUN J. N., 1963). Pour monter l’organe dans la cuve, une de ses 2 extrémités a été attachée au fond de la cuve à l’aide d’un fil inextensible et l’autre extrémité a été reliée à un stylet enregistreur avec un contre poids de 1g (WANSI S. L. et coll., 2014). La préparation a été laissée se stabiliser pendant 45 minutes. Pendant cette période, elle a été rincée toutes les 15 minutes. Après le rinçage, l’organe a été sensibilisé, et sa viabilité a été testée en injectant de l’acétylcholine à la concentration de 10-4 M dans le bain. Ensuite, l’organe a été rincé et laissé se stabiliser de nouveau pendant 45 minutes, et toutes les 15 minutes, il a été rincé. Après cette période, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative afin de réaliser des concentrations croissantes à partir de 10-11 M dans le bain jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Au plateau de la contraction, l’extrait a été injecté dans le bain d’une manière cumulative à partir de 0,1 mg/ml jusqu’au relâchement total de l’organe. Le volume total des produits injectés dans le bain n’a pas excédé 10 % du volume du bain (CAVALCANTE A. F. et coll., 2012). La CI50 de l’extrait a été déterminée graphiquement en rapportant sur un papier millimétré l’amplitude de la contraction de l’iléon en fonction de la concentration de l’extrait dans le bain. Etude de l’activité anti-diarrhéique de l’extrait RSN16 RAKOTONIAINA Salohy Naharisoa 10 4. Etude du mécanisme d’action de l’extrait RSN16 Le mécanisme d’action de l’extrait RSN16 a été étudié en pré incubant l’iléon dans un bain contenant l’extrait avant de le contracter avec l’acétylcholine (SABLASSOU K. et coll., 1998). Après la période de stabilisation et le test de viabilité, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative jusqu’à la contraction maximale. Au plateau de la contraction, la préparation a été rincée puis laissée se stabiliser. Ensuite, l’extrait a été injecté dans le bain pour réaliser une concentration finale de 0,125 mg/ml, puis l’organe a été laissé en contact avec l’extrait pendant 10 minutes, et l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. La préparation a été, ensuite, rincée de nouveau et laissée se stabiliser avant d’injecter l’extrait dans le bain pour réaliser une concentration de 0,25 et 0,5 mg/ml lors de la 2 ème et 3 ème manipulation. Les contractions de l’organe provoquées par l’acétylcholine ont été enregistrées et leur amplitude a été mesurée. Les contractions ont été exprimées en pourcentage par rapport à la contraction maximale provoquée par l’acétylcholine seule qui a été considérée comme 100 %. Effet Les CE50 de l’acétylcholine en absence et en présence de l’extrait ont été déterminées graphiquement en rapportant l’effet de l’acétylcholine en fonction de sa concentration dans le bain, sur un papier semi logarithmique. C- EXPRESSION ET ANALYSES DES RESULTATS Les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne ± écart type réduit ( ̅ ± e.s.m). Les moyennes obtenues ont été comparées entre elles en utilisant le test « t » de Student avec un degré de signification P < 0,05. RESULTATS Etude de l’activité anti-diarrhéique de l’extrait RSN16 RAKOTONIAINA Salohy Naharisoa 11 III- RESULTATS A- PARTIE CHIMIQUE

Rendement de l’extraction

L’évaporation à sec du filtrat obtenu avec 250 g de poudre dans un mélange éthanol – eau (60 : 40) pendant 3 jours, donne 40 g d’extrait RSN16 pâteux de couleur marron, ce qui correspond à un rendement de 16 %. 2. Résultats du criblage phytochimique Le criblage phytochimique effectué sur l’extrait RSN16 révèle la présence de tanins et d’alcaloïdes en forte teneur, de terpenoïdes et de sucres réducteurs en teneur moyenne, et enfin de composés phénoliques, de flavonoïdes, de leuco anthocyanes et d’anthocyanes en faible teneur (Tableau II). Tableau II. Familles chimiques présentes dans l’extrait RSN16 FAMILLES CHIMIQUES TENEUR RELATIVE ALCALOÏDES +++ TANINS +++ TERPENOÏDES ++ SUCRES REDUCTEURS ++ FLAVONOÏDES + LEUCOANTHOCYANES + ANTHOCYANES + COMPOSES PHENOLIQUES + Etude de l’activité anti-diarrhéique de l’extrait RSN16 RAKOTONIAINA Salohy Naharisoa

PARTIE BIOLOGIQUE 

Effet de l’extrait RSN16 sur la sécrétion intestinale

L’administration par voie orale de sulfate de magnésium (MgSO4) chez les cobayes augmente le volume du fluide dans la lumière intestinale de ces animaux. Le volume du fluide intestinal chez les animaux traités avec de l’extrait RSN16 est inférieur à celui des animaux témoins. Le volume du fluide intestinal diminue en augmentant la dose administrée. Chez le lot témoin, il est égal à 3,8 ± 0,15 ml contre 3,03 ± 0,12 ml et 2,73 ± 0,06 ml chez les animaux traités avec l’extrait RSN16 aux doses respectives de 150 et 300 mg/kg (P < 0,05) (Figure 2). Figure 2. Variation du volume du fluide intestinal après l’administration de MgSO4 chez les cobayes témoins ( ) et traités avec RSN16 administré par voie orale aux doses de 150 ( ) et 300 mg/kg ( ) ( ̅ ± e.s. m ; n=3; P < 0,05). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 témoin 150 mg/kg 300 mg/kg Volume (ml) Dose mg/kg Etude de l’activité anti-diarrhéique de l’extrait RSN16 RAKOTONIAINA Salohy Naharisoa 

Effet de l’extrait RSN16 sur la motilité intestinale

L’injection d’Acétylcholine d’une manière cumulative dans le bain contracte l’iléon de cobaye, et l’amplitude de la contraction augmente en fonction de la concentration de l’acétylcholine dans le bain. La contraction maximale (100 %) est obtenue à la concentration de 10-6 M dans le bain. L’administration de RSN16 de manière cumulative dans le bain relâche l’iléon contracté par l’acétylcholine à partir de la concentration 0,1 mg/ml dans le bain, et à la concentration de 1,6 mg/ml, il le relâche complètement. La CI50 de l’extrait est égale à 0,46 mg/ml (Figure 3).

Mécanisme d’action de l’extrait RSN16

En pré incubant l’iléon isolé dans le bain avec l’extrait RSN16, l’amplitude de la contraction maximale de l’iléon provoquée par l’acétylcholine diminue et sa CE 50 augmente. En absence de l’extrait, l’effet maximal de l’acétylcholine passe de 100 % à 76,58 ± 2,43 % , 65,76 ± 1,73 % et 29,73 ± 1,04 % respectivement en présence de l’extrait aux concentrations de 0,125, 0,250 et 0,500 mg/ml. D’autre part, sa CE50 passe de 2,8.10-9 M à 1,4.10-8 M , 6,6.10-8 M et 1,3.10-7 M en présence de l’extrait aux concentrations respectives de 0,125 , 0,250 et 0,500 mg/ml dans le bain (Figure 4).