Evaluation in vivo des régulateurs de croissance sur le développement d’un ravageur des denrées stockées

Présentation du matériel biologique

Ephestia kuehniella est un insecte lépidoptère holométabole, elle appartient à la famille des pyralidés. C’est un insecte cosmopolite appelé couramment la pyrale de la farine ou bien la teigne de la farine. Elle est considérée comme l’un des ravageurs les plus nuisibles des denrées stockées. Les larves de ce dernier peuvent occasionner d’importants dégâts. Elles s’attaquent à la farine, au blé moulu, aux flocons d’avoine, aux céréales,…etc. Sa position systématique est la suivante (Tableau 1) : Règne Animalia Sous-règne Metazoa Embranchement Arthropoda Sous-embranchement Hexapoda Classe Insecta Sous-classe Pterygota Infra-classe Neoptera Super-ordre Endopterygota Ordre Lepidoptera Famille Pyralidae Sous- famille Phycitinae Genre Ephestia Espèce kuehniella Tableau 1. Position systématique

Elevage et cycle de développent

E. kuehniella est une espèce gonochorique. L’accouplement débute immédiatement après le début de la vie d’adulte, la femelle est capable de déposer jusqu’à 350 ±50 œufs qui s’attachent aux divers aliments par une sécrétion collante. La discrimination entre mâle et femelle est évidente dans le stade larvaire, le mâle porte une tâche brune sur la partie dorsale, tandis que la femelle non (Figure 1).

Cycle de vie

Le cycle de développement dure 75 jours à une température de 27°C et une humilité relative de 70 % passe par 4 stades (Figure 5). Stade œuf : Les œufs des pyrales sont généralement plats et ovales, l’œuf nouvellement pondus d’E. kuehniella est elliptique de couleur blanche et brillante (Figure 2). Juste avant l’éclosion l’œuf devient jaune clair en raison du développement de l’embryon (Kamel, 1969). L’œuf est de 500-550 µm de long par 290-327µm de large (Khebbeb et al., 2008). Son poids est 0,023 mg. Les œufs éclosent en 96 heures à 30 °C et 73% d’humidité relative (Brindley, 1930). Figure 2. Œuf d’E. kuehniella (photo personnelle) Stade larvaire: Après l’éclosion, les larves sont de 0,866 mm de longueur et 0,199 mm de largeur pesant 0,018 mg. Les larves achèvent le développement et passent par six stades. La larve mature est de 12,6 ± 0,78 mm de long avec un poids moyen de 27,8mg. La largeur de la capsule a été utilisée comme critère pour identifier les stades (Athanassiou, 2006). 3 mm 200 µm Matériel et Méthodes 9 Figure 3. E. kuehniella à différents stades larvaires (photo personnelle) Stades chrysalide : Arrivés à maturité, les larves rampent à la surface de la matière sur laquelle ils se nourrissent. E. kuehniella se nymphose dans des cocons soyeux. Les chrysalides sont de couleur vert pâle au stade précoce, puis elles tournent à brun rougeâtre et durant le dernier jour de développement, les chrysalides deviennent de couleur foncée. La taille moyenne des pupes est 9 mm de long et 2,21 mm de large (Figure 4). Figure 4. Chrysalides d’E.kuehniella à différents stades (photo personnelle) Stade d’adulte : Les adultes mesurent 10-14 mm de long au repos ; avec une envergure de 20-25 mm. Les ailes antérieures sont grises avec des barres transversales ondulées sombres et une rangée de taches sombres à la pointe. Les ailes postérieures sont blanches. 1,73mm 3mm Matériel et Méthodes 10 Figure 5. Cycle de vie d’E. kuehniella (photo personnelle) 2.2.2. Elevage au laboratoire Les larves de dernier stade d’E. Kuehniella sont récupérées à partir de la farine infestée et mise dans des boites en plastique ou se trouve un papier plissé ; au niveau des quelles les larves vont nymphoser. On place les boites dans une étuve (Memmert) régulée à une température de 27 °C et un taux d’humidité de 80 % (Figure 6). Figure 6. Elevage au laboratoire (photo personnelle) 2 mm 2 mm 3 mm 200 µm .

Présentation des insecticides 

Les agonistes des ecdystéroïdes

Le RH-5849 et le tebufenozide sont des dérivés de la diacylhydrazine à structure nonstéroïdale qui interfèrent avec le processus de mue en mimant l’action de la 20E. La matière active a été aimablement fournie par le Professeur Smagghe (Laboratoire d’Agrozoologie, Université de Gant, Belgique). Le prototype (RH-5849) est le nom commun de 2-dibenzoyl-1-tert-butylhydrazine, est le premier agoniste des ecdystroides synthétiser par la compagnie Rohm & Haas (Spring House PA, USA) d’où il a acquis le nom de prototype. Sa formule empirique est : C18H20N2O2 et son poids moléculaire est de 260,40g. Tebufenozide (RH-5992) est le nom commun de N-tert-butyl-N′-(4-ethylbenzoyl)-3,5- dimethylbenzohydrazide. Il est commercialisé sous le nom de Mimic®. Sa formule empirique est : C22H28N2O2 et son poids moléculaire est de 352,48g. 

Le mimétique de l’hormone juvénile

Kinoprène ou Ester, 2-propynyl (E,E)-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate, (65% EC, Wellmark, International Inc., IL, USA) . Sa formule empirique est C18H28O2 et son poids moléculaire 276.41g. Les formules moléculaires des trois produits sont représentées dans la figure 7. Figure 7. Structure chimiques des régulateurs de croissances (A): prototype; (B): tebufenozide et (C): kinoprène.

Traitement des insectes

Les chrysalides nouvellement exuviées sont récupérées dans des boites de pétri. Le prototype, le tebufenozide et le kinoprène ont été dilués dans l’acétone et administrés, in vivo, à des chrysalides femelles nouvellement exuvies par application topique de 2µl sur la face ventrale de l’abdomen à l’aide d’une micropipette respectivement à leurs DL50 et DL90. Pour le RH-5849 : 0,05 μg/chrysalide et 0,18 μg/chrysalide, et le tebufenozide : 0,005 μg/chrysalide et 0,05 μg/chrysalide, qui ont été déterminées précédemment (Hami et al., 2005). Pour le kinoprène : 0,00025 µg/insecte et 0,004 µg/insecte. Les chrysalides traitées et témoins sont déposées dans des boites de pétri. Elles sont ensuite mises dans l’étuve à 27°C et une humidité de 80%.

Etude toxicologique

Le kinoprène, ester (65% EC, Wellmark,International Inc., IL, USA), a été administré par application topique de 2µl chez les chrysalides femelles nouvellement exuviées d’E .kuehniella à différentes doses (0,01; 0,005; 0,001; 0,0002; 0,0001 µg/2µl ) et la dilution de l’insecticide se fait dans l’acétone. Pour chaque dose, 5 répétitions ont été réalisées, chacune comporte 20 chrysalides, une série témoin est conduite en parallèle et les individus ne reçoivent aucun traitement. L’inhibition observée est exprimée en pourcentage, ces derniers sont corrigés par la formule d’Abott (1925) qui permet d’éliminer la mortalité naturelle. Les pourcentages d’inhibitions corrigées subissent une transformation angulaire selon les tables de Bliss (1938), cités par Fisher et Yates (1957). Les données normalisées font l’objet d’une analyse de la variance à un critère de classification qui permet le classement des doses par le test HSD de Tukey. Enfin, la régression non linéaire exprimant le pourcentage d’inhibition corrigée en fonction du logarithme de la dose a permis d’estimer les doses d’inhibition du kinoprène , la DI50 et la DI90. 2.6. Dissection et prélèvement de la cuticule Les chrysalides femelles âgées 0, 1, 3, 5, 7, 9 des séries témoins et traitées sont disséquées sous une loupe binoculaire, fixées par une aiguille sur une boite de paraffine, Les téguments ont été isolés et débarrassés des masses musculaires et des tissus adipeux et la  cuticule est récupéré. Ces cuticules prélevées ont été utilisées pour l’étude de différents paramètres de développement.

Détermination du contenu cuticulaires en chitine et protéines

La technique utilisée est celle de Bordereau & Andersen (1978), décrite précédemment (Soltani et al., 1996). Les pièces prélevées (cuticules des chrysalides âgées 0, 1, 3, 5, 7, 9) ont été lavées dans un mélange éther-chloroforme pendant 24 heures à température ambiante afin d’éviter toutes traces lipidiques; puis rincées à l’alcool à 96° et séchées à 60°C pendant une heure jusqu’à l’obtention d’un poids sec constant P1. Un traitement à la soude (2N) à 100°C pendant 2 heures permet l’hydrolyse des protéines et le résidu obtenu correspond à la chitine; celui-ci a été lavé à l’éthanol absolu et séché à 60°C jusqu’à l’obtention d’un second poids sec constant P2. La différence P1 – P2 exprime la quantité de protéines totales cuticulaires.

Technique électrophorétique

Extraction et dosage des protéines

Les cuticules (pool de 6) sont prélevées des femelles adultes d’E. kuehniella témoins et traitées à l’apolyse. Les échantillons sont conservés dans une solution de PMSF à 0,1 % dans l’eau distillée. L’extraction est effectuée à 4°C sous agitation pendant 24 heures. L’homogénat est centrifugé à 5000 tours/min pendant 15 minutes. Le surnageant est alors récupéré et une fraction aliquote (100 µl) est destinée à la quantification des protéines selon la méthode de Bradford (1976) et l’autre fraction est lyophilisée et servira à l’étude électrophorétique des protéines.

Principe de l’électrophorèse

L’électrophorèse est une technique de séparation fondée sur le fait que les molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes lorsqu’elles sont placées dans un champ électrique. La vitesse de migration dépend également du poids moléculaire, ainsi que des propriétés amphotères de la protéine (Lemoine, 1980; .Mauer, 1991). La séparation électrophorétique des protéines est réalisée selon la technique de Laemmli, (1970). Il s’agit d’une électrophorèse verticale sur gel de polyacrylamide (PAGE) à 30 %. Ce gel joue le rôle d’un tamis moléculaire additionné de sodium dodécyl sulfate (SDS) Matériel et Méthodes 14 à 10%. Le SDS est un détergent anionique qui dénature les protéines et leur donne une charge négative ce qui donne une densité de charge équivalente par unité de longueur de polypeptide. Par conséquent, les protéines vont migrer dans le gel et la distance parcourue sera en corrélation avec leur poids moléculaire (Kaufman, 1995). 2.8.3. Montage de l’appareil L’appareil est composé d’une mini cuve de 7 x 8 cm avec deux faces identiques comportant deux plaques d’alumine, deux plaques de verre, deux espaceurs d’une épaisseur de 1,5 mm, 4 pinces, 2 peignes, un chapeau avec électrodes et une cuve à tampon de migration. Avant de couler le gel, on met de l’agarose à 2% préalablement chauffée au bain marie sur une plaque de verre afin de boucher le vide entre la plaque d’alumine et la plaque de verre. Les gels sont préparés extemporanément. On coule d’abord le gel de séparation ou running gel (12,5 %) entre la plaque d’alumine et la plaque de verre et on laisse polymériser pendant 30 mn (Tableau 2). On prépare ensuite le gel de concentration (4,5%) ou stacking gel, que l’on fait couler jusqu’aux bords des plaques. On place enfin les peignes qui serviront au moulage des dix chambres de dépôt, puis on laisse polymériser pendant 30 mn (Tableau 2). Après polymérisation du gel de concentration, on remplit la cuve de tampon de migration ou running buffer (Tableau 3). On enlève délicatement le peigne, les puits sont prêts pour le dépôt des échantillons.