Interactions lumière-matière, luminescence

Comme on l’a vu, l’observation du vivant a été un moteur tout au long du développement des microscopes pour accroître le pouvoir résolvant de l’instrumentation. Parallèlement à ce développement instrumental, il a fallu répondre à de nouvelles questions : que voit-on grâce à un microscope ? En effet le microscope va permettre de collecter des photons qui ont interagi avec l’échantillon. Or, l’interaction entre la lumière et la matière peut fournir un grand nombre d’informations très variées et complémentaires. Le principe de base est à chaque fois le même, des photons à une certaine (ou plusieurs) longueur(s) d’onde sont envoyés sur l’échantillon et on collecte des photons provenant de l’échantillon, qui vont nous renseigner sur son interaction avec la lumière. Différents types de photons sont collectés : – si l’échantillon n’est pas opaque, une certaine partie des photons envoyés va traverser l’échantillon. Certains vont passer au travers rapidement sans être déviés, d’autres vont changer de trajectoire, d’autres vont être retardés, d’autres encore vont voir leur polarisation changer. Ces photons transmis, s’ils sont collectés, vont permettre de remonter à des caractéristiques optiques de l’échantillon comme par exemple ses propriétés de diffusion, son indice optique, qui pourront ensuite être reliées à des caractéristiques biologiques.  – une certaine partie des photons envoyés va rebrousser chemin. Des phénomènes de réflexion aux interfaces de l’échantillon (aussi bien entre l’air et l’échantillon qu’à l’intérieur même de l’échantillon), ou de rétrodiffusion vont ainsi être mis en évidence et renseigner sur la nature de l’échantillon. – enfin, en interagissant avec la lumière, l’échantillon va pouvoir sous certaines conditions permettre la génération de nouveaux photons de longueurs d’ondes différentes. C’est le cas, par exemple, de la luminescence (que nous allons détailler dans la suite), de la génération d’harmoniques supérieures qui va renseigner sur la structure et la propriété de symétrie de certaines entités (génération de second harmonique SHG, ou de troisième harmonique THG), de l’effet Raman stimulé qui permet de mettre en évidence des transitions vibrationnelles (CARS pour Coherent Anti-Stokes Raman Scattering). 

La microscopie de fluorescence

Un des objectifs principaux des améliorations techniques en microscopie au fil des années, a été d’augmenter la capacité à distinguer ce qui est intéressant (le signal) de ce qui ne l’est pas (le fond). Par son décalage en longueur d’onde entre l’excitation et l’émission, la fluorescence s’est affirmée comme un outil indispensable, notamment dans l’observation du vivant. En effet, en utilisant des outils de sélection spectrale appropriés, on va pouvoir collecter uniquement le signal de fluorescence, et donc avoir un contraste de très bonne qualité. Il existe différents types de fluorophores qui sont utilisés en microcopie de fluorescence suivant les échantillons observés et les processus et phénomènes étudiés. Certains fluorophores, dits endogènes, sont synthétisés par les organismes vivants, et sont présents naturellement dans les échantillons biologiques. Ils sont responsables de l’autofluorescence. Nous pouvons citer par exemple le tryptophane, qui est un des acides aminés entrant dans la composition de nombreuses protéines, la nicotinamide adénine dinucléotide (ou NADH sous sa forme de réducteur) et les flavines, qui sont des coenzymes d’oxydoréduction, ou encore la porphyrine, qui est une molécule impliquée dans le transport de l’oxygène. Malheureusement, ces fluorophores sont assez limités et leur utilisation n’est pas aisée. Ils ont en effet des propriétés spectroscopiques assez complexes, notamment avec des spectres d’absorption assez chahutés, qui se recouvrent, et dans des longueurs d’onde assez basses (dans l’ultraviolet)Conscients du potentiel de la microscopie de fluorescence, de nombreux chimistes organiciens ont travaillé à la synthèse de plusieurs milliers de sondes fluorescentes de rendements quantiques élevés et compatibles avec le vivant. Grâce à ces développements, il est aujourd’hui envisageable de marquer n’importe quel aspect des systèmes biologiques [Invitrogen 2007]. La large gamme spectrale des fluorophores disponibles permet l’imagerie simultanée de plusieurs composants Chapitre I : Présentation des concepts et état de l’art 20 cellulaires, sub-cellulaires ou moléculaires. La découverte en 1962 de la Green Fluorescent Protein (GFP) [Shimonura 1962] fut un véritable tournant. Cette protéine, synthétisée naturellement par la méduse Aequorea Victoria est un « produit » des gènes intrinsèquement fluorescent. Ainsi, quand une trentaine d’années plus tard, les biologistes moléculaires réussirent à séquencer les nucléotides puis à coder la séquence de la GFP dans des bactéries, cette protéine devint un marqueur puissant pour l’expression des gènes [Chalfie 1994]. Aujourd’hui, avec ses protéines dérivées produites par différentes mutations et qui couvrent des spectres différents (Cyan Fluorescent Protein CFP, Yellow Fluorescent Protein YFP,…), la GFP est devenue quasiment incontournable (figure 1-10). Pour l’avenir, de nombreux espoirs sont fondés sur les boîtes quantiques colloïdales, appelés plus couramment sous leur désignation anglo-saxonne : les quantum dots [Bruchez 1998]. Ces nanocristaux inorganiques présentent de nombreux avantages : ils possèdent des rendements quantiques bien supérieurs à ceux des fluorophores organiques, ont des temps de vie de fluorescence plus longs, et surtout ne souffrent pas du photoblanchiment et des autres photodégradations. Mais actuellement, les difficultés liées à leur intégration au sein d’organismes vivants, ainsi que leur clignotement, réstreignent leur utilisation, même si des premiers résultats prometteurs ont été démontrés ces dernières années [Michalet 2005], [Mahler 2008]. Toute cette effervescence autour de la fluorescence est aussi due en grande partie à la découverte de l’effet laser et au développement des sources lasers, qui sont des outils quasiment indissociables de la microscopie de fluorescence. Les caractéristiques intrinsèques du rayonnement laser, à savoir sa monochromaticité, sa forte densité spectrale de puissance, son confinement spatial et sa capacité à fonctionner en régime impulsionnel ultracourt, permettent d’exciter sélectivement et efficacement les fluorophores. Différents types de contrastes peuvent être mis en évidence grâce à la microscopie de fluorescence. Dans la suite, nous nous concentrons sur la mesure de temps de vie de fluorescence, qui est la technique que nous utilisons.