L’APPORT DU GENEXPERT DANS LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE PULMONAIRE

Mise en évidence des agents de la tuberculose 

 Examen microscopique

 L’examen microscopique des crachats permet d’identifier de manière rapide et fiable les patients atteints de la tuberculose pulmonaire si la charge bacillaire est supérieure à 5000 bacilles/ml de crachat. La recherche directe de bacille tuberculeux est permise par la propriété ~ 14 ~ d’acido-alcoolo-résistance du genre Mycobacterium. Deux colorations sont couramment utilisées : la coloration de Ziehl-Neelsen à chaud et la coloration à l’auramine.  La coloration spécifique de Ziehl-Neelsen (figure 4) C’est la coloration de référence. Elle utilise la fuchsine phéniquée à chaud suivie d’un traitement par un acide fort et par l’alcool. Les mycobactéries ou bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) conservent la coloration rouge vif de la fuchsine sur le fond bleu de la préparation ; les autres cellules et bactéries apparaissent en bleu. La lecture est cependant difficile et plus lente. Figure 4 : Technique de coloration de Ziehl-Neelsen à chaud (Source : http://syara-fadlah.blogspot.sn/2012/03/mycobacterium-tuberculosis.html)  La coloration de fluorescence ou méthode de Degommier (figure 5) Plusieurs laboratoires ont remplacé la technique de Ziehl-Neelsen par celle de la coloration à l’auramine phéniquée, qui présente les mêmes propriétés que la fuchsine pour colorer les mycobactéries. L’observation est effectuée sur un microscope à fluorescence, à l’objectif x 25, ce qui permet d’examiner la totalité du frottis en 5 minutes. ~ 15 ~ Figure 5 : Technique de coloration à l’auramine (Source : https://www.institutpasteur.nc/latuberculose/) 

 La culture bactérienne

 Trois types de milieux peuvent être utilisés pour la culture de mycobactéries : milieu solide à base d’œuf (par exemple, Löwenstein Jensen) ; milieu solide à base d’agar (par exemple, Middlebrook 7H11) et le bouillon liquide (par exemple Middlebrook 7H12). Les milieux solides sont faits pour être sélectifs pour les mycobactéries en ajoutant des antibiotiques. Les milieux non sélectifs, sur lesquels la croissance est plus rapide, sont disponibles au marché. La croissance est plus rapide dans 5% à 10% de dioxyde de carbone. Les bouillons de culture liquide ont besoin de 1 à 3 semaines d’incubation pour la détection d’organismes, par comparaison avec des milieux solides, qui nécessitent de 3 à 8 semaines. Cependant, les milieux solides permettent l’examen de la morphologie des colonies, la détection des cultures mixtes, et la quantification de la croissance. En outre, les souches occasionnelles de mycobactéries ne peuvent croître sur des milieux solides. Pour ces raisons, les experts suggèrent d’utiliser des milieux liquides et solides en conjonction avec l’inoculation d’au moins un milieu de culture solide (BENGUEDOUAR, 2016).

Diagnostic immunologique 

Intradermo-réaction à la tuberculine (IDR)

 L’IDR ou test de Mantoux a été le premier test mis au point pour le diagnostic immunologique de la tuberculose. Il consiste en l’injection intradermique d’un volume de 0,1 ml de tuberculine, dérivé protéinique purifié (PPD), obtenu à partir d’un surnageant de culture de M. tuberculosis. La tuberculine contient plus d’une centaine d’antigènes communs à de nombreuses espèces mycobactériennes dont le M. bovis utilisé pour le vaccin B.C.G et toutes ~ 16 ~ les mycobactéries environnementales ou non tuberculeuses (MNT). Ce test mesure la réponse in vivo d’hypersensibilité à médiation cellulaire, après injection intradermique de tuberculine. C’est une réaction inflammatoire locale tardive, de durée prolongée et caractérisée par la migration des cellules immunocompétentes vers les tissus contenant l’antigène : dans les heures suivant l’injection, il se produit un afflux de monocytes-macrophages, la formation de cellules géantes multinucléées et l’afflux d’un grand nombre de lymphocytes T CD4 mémoires spécifiques de la tuberculine (COSTANTINO, 2010). 

 Test de libération d’interféron gamma 

Ces tests reposent sur le principe selon lequel des lymphocytes T préalablement sensibilisés à des antigènes tuberculeux produisent des concentrations élevées d’interféron gamma en cas de réexposition aux mêmes antigènes mycobactériens. Le substrat antigénique utilisé initialement était la tuberculine, remplacée dans un deuxième temps par des antigènes plus spécifiques de M. tuberculosis : ESAT-6, CFP-10 et TB7. Ce dernier est beaucoup plus sensible et plus spécifique que l’IDR (PAI et al, 2008). Ils existent deux types de tests commercialisés : QuantiFERON-TB® et tests T-SPOT.TB® ➢ Le test Quantiféron est réalisé sur sang total, l’interféron (IFN) produit est dosé par une technique ELISA et le résultat est exprimé en unité internationale d’IFN par ml de plasma (UI/ml). ➢ Le test T-Spot.TB est réalisé sur cellules mononucléées isolées et ajustées à concentration précise, le nombre de cellules T spécifiques sécrétant de l’IFN est quantifié par une technique ELISpot et le résultat est exprimé en cellules formant des spots (SFC) par puits (MEIER et al, 2005). 

Diagnostic moléculaire 

Tests basés sur l’amplification génique par PCR 

Des tests réalisables à partir de cultures liquides ou solides permettent la détection, l’identification de nombreuses espèces mycobactériennes en trois étapes : une étape d’extraction d’ADN, une étape d’amplification par PCR de régions d’intérêt et une étape d’hybridation inverse.  Le test INNO-LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics) permet la détection des bactéries du genre Mycobacterium et l’identification de 16 espèces mycobactériennes différentes. L’amplification génique concerne la région codant l’espace 16S-23S de l’ARN ribosomal   et l’identification se fait par hybridation inverse des produits de PCR avec des sondes d’ADN biotinylées et immobilisées sur des bandelettes.  Le test Hain (Life sciences) utilise lui aussi les principes de l’hybridation inverse mais l’amplification concerne des régions différentes en fonction de l’identification souhaitée : les sous-espèces du complexe M. tuberculosis (GenoType® MTBC), les mycobactéries atypiques communes (GenoType® Mycobacterium CM (Common Mycobacteria)) ou les autres mycobactéries atypiques (GenoType® Mycobacterium AS (Additional Species)) (MILLET, 2011).  Le test Xpert MTB/RIF : Il s’agit d’une PCR en temps réel automatisée semi-quantitative permettant d’établir à la fois la présence de M. tuberculosis et des mutations les plus fréquentes du gène rpoB indiquant une résistance à la rifampicine en moins de 2 heures. Ce test permet de réaliser, à la demande et dans une seule cartouche, les différentes étapes d’extraction, purification, amplification d’ADN, hybridation des sondes et détection multiplex. L’amplification génique cible la région de 81 pb du gène rpoB, qui code la sous unité β de l’ARN polymérase et qui héberge les principales mutations responsables de la résistance à la rifampicine. Cette dernière est couplée avec cinq balises moléculaires ou probes (A, B, C, D, E de type « beacons ») qui se chevauchent le long de la séquence cible. L’utilisation du système Xpert MTB/RIF s’applique à des échantillons d’expectorations (y compris les pellets provenant de prélèvements décontaminés). Les études récentes sur l’évaluation de la performance diagnostique de ce test ont montré que la sensibilité par rapport à la culture était de plus de 98 % pour les prélèvements à microscopie positive mais de 68 % pour les prélèvements à microscopie négative (STEINGART et al, 2013). Le test Xpert MTB/RIF est actuellement la seule technique parvenue à maturité et il représente une nouvelle génération de plates-formes de diagnostic moléculaire automatisé (TIMOUYAS, 2017). 

 Autres développements 

Les tests immuno-chromatographiques : permettent la détection de l’Antigène MPT64, protéine uniquement secrétée par les souches du MTbC (« S.D. BioLINE TB MPT64 Rapid », Standard Diagnostic et « Capilia TB Neo », Tauns laboratories). Utilisables à partir de colonies provenant de cultures sur milieu solide ou liquide, ils permettent une distinction rapide (en quelques minutes) entre les souches du MTbC et les mycobactéries atypiques, – Les tests de détection et d’identification des mycobactéries à partir de prélèvements biologiques : ~ 18 ~ basés sur l’amplification d’ADN (COBAS® TaqMan® MTB Test, Roche Diagnostics) ou d’ARN (AMPLIFIED MTD®, Gen-Probe ; GenoType® Mycobacteria Direct, Hain Lifescience), ils permettent d’identifier les bactéries du MTbC dans les prélèvements à examen direct positif en quelques heures. Cependant, ces tests restent moins sensibles que la méthode de référence qui nécessite la mise en culture des prélèvements biologiques et seront donc principalement employés en première intention pour un nombre restreint de situations qui auront été préalablement définies (MILLET, 2011). 

Traitement de la tuberculose 

Traitement prophylactique 

L’injection du vaccin de bacilles de Calmette et Guérin (fabriqué à partir de bacille bovin vivant atténué par repiquages successifs en culture) permet à l’organisme d’acquérir une immunité contre le bacille de Koch équivalente à celle qui est obtenue après une primo-infection. La protection apportée par le BCG est de 50%. Les études effectuées dans de nombreuses régions du globe montrent que la vaccination par le B.C.G. des nouveau-nés et des enfants d’âge préscolaire permet, lorsqu’elle est bien pratiquée, de les protéger efficacement contre toutes les formes de la tuberculose infantile et spécialement contre les formes graves et parfois mortelles de la maladie (méningite ou miliaire tuberculeuse). Toutefois, il ne protège pas de façon fiable contre la tuberculose pulmonaire, qui représente la plus grande part de la charge de la maladie dans le monde (BENGUEDOUAR, 2016). 

 Traitement curatif 

Le traitement de la tuberculose est basé sur l’application d’une chimiothérapie basée sur l’association de plusieurs antibiotiques antituberculeux. La durée de cette chimiothérapie est actuellement de 6 mois et constitue « la chimiothérapie de courte durée ». Le régime 2SRHZ / 4RH (OULD ABBES, 2012), est un traitement standard qui fait appel aux antibiotiques dits de « première ligne ». Il comporte une phase initiale intensive de deux mois avec administration quotidienne de streptomycine (S), rifampicine (R), isoniazide (H) et pyrazinamide (Z), qui est suivie d’une phase de continuation de quatre mois avec administration quotidienne de rifampicine et d’isoniazide. – L’isoniazide et la rifampicine sont les plus puissants et représentent des médicaments majeurs, hautement bactéricides.