Propriétés biologiques de Streptomyces isolé à partir du sol rhizosphérique d’une espèce de baobab

Échantillonnage de sol

Les échantillons de sol sur lesquels l’étude est menée, sont prélevés sous les 5 espèces de baobabs (Adansonia) endémiques de Madagascar : Adansonia madagascariensis, Adansonia digitata et Adansonia za situés dans la région Boina (15° 19’ 00″ S, 46° 19’ 00″ E, Altitude 20 m) (Ouest de Madagascar), Adansonia grandidieri et Adansonia rubrostipa situés dans le district de Morondava (20° 17′ 19″ S, 44° 19′ 04″ E, Altitude 8 m) de la région Menabe (Moyen Ouest de Madagascar). Les prélèvements ont été effectués à une profondeur située entre 10 cm et 20 cm à raison de 3 échantillons par espèce et par site. Ces sols ont été conditionnés dans des sachets stériles de 15 cm x 16 cm, transportés au laboratoire et séchés à température ambiante au moins une semaine. 

Isolement des souches d’Actinomycètes

Trois méthodes d’isolement des Actinomycètes ont été utilisées afin d’obtenir le maximum d’Actinomycètes présents dans les échantillons de sol étudiés. La sélection par l’antibiotique : en plus des antibiotiques inhibiteurs de croissance des bactéries Gram négatif (l’acide nalidixique : 25 µg / mL), et des champignons (cycloheximide : 50 µg / mL), un autre antibiotique, la tétracycline (5 µg / mL) servant d’agent sélectif a été ajouté au milieu d’isolement. L’échantillon de sol (1 g) est mis en suspension dans de l’eau distillée stérile (9 mL). Après agitation, des dilutions 10-1 à 10-3 sont préparées et 0,1 mL de cette suspension aux dilutions 10-2 , 10-3 est étalé sur des boîtes de Pétri contenant le milieu AS1A avec de la tétracycline. Le traitement à 100°C : cette méthode permet d’isoler les Actinomycètes résistants à 100°C. L’échantillon de sol sec est exposé à 100°C pendant une heure, puis mis en suspension dans de l’eau distillée stérile (9 mL), dilué (dilutions 10-1 à 10-3 ), déposé, et étalé sur milieu AS1A. Grayson aeroslized sampler : cette méthode permet de collecter les spores d’Actinomycètes présentes dans les échantillons de sol étudié. L’échantillon de sol est agité vigoureusement dans une bouteille en plastique, puis laissé reposer pendant une heure. Les spores d’Actinomycètes disséminées dans le GAS sont collectées dans le milieu AS1A. 2-3. Mise en évidence de l’activité antifongique des souches actinomycétales L’activité antifongique des isolats d’Actinomycètes a été mise en évidence selon la technique des cylindres d’agar [6] sur 5 germes-tests comprenant 3 champignons pathogènes humains : Candida albicans, Candida tropicalis, Candida guillermondi et deux souches phytopathogènes des plantes : Fusarium sp. et Aspergillus sp. de lacollection des souches microbiennes du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement. Les souches d’Actinomycètes sont ensemencées en stries serrées sur milieu AS1A et incubées pendant 14 jours à 30°C, alors que celles des champignons sont ensemencées sur milieu PDA et incubées à 28°C pendant 7 jours. Des cylindres d’agar de 6 mm de diamètre des souches d’Actinomycètes et des souches fongiques sont ensuite découpés à l’aide d’emporte-pièces dans les cultures précédentes. Les cylindres d’agar des souches actinomycétales sont transférés aseptiquement sur les côtés des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA, tandis que ceux des souches fongiques sont déposés au centre des boîtes de Pétri. L’activité a été estimée par la mesure des zones d’inhibition après 4 jours d’incubation. Seuls les isolats montrant une zone d’inhibition supérieure à 8 mm ont été considérés comme souches actives. Trois répétitions sont effectuées pour chaque test. La nystatine (100UI) est l’antifongique de référence utilisée [7]. Compte tenu des résultats du test d’activité antifongique, les souches d’Actinomycètes présentant un large spectre d’activité antifongique (souches représentatives) ont été sélectionnées pour extraire les métabolites secondaires produits afin d’évaluer l’activité antioxydante.

Évaluation de l’activité antioxydante

L’évaluation de la capacité antioxydante de l’extrait préparé à partir de la souche d’Actinomycète représentative R212 (présentant un large spectre d’activité antifongique) in vitro a été effectuée par la mesure du pouvoir de piégeage du radical DPPH (1,1-diphényl-2-picryhydrazyl) [8]. Le pouvoir antioxydant del’extrait testéa été estimé par comparaison avec un antioxydant naturel, l’acide ascorbique. Deux millilitres de chaque extrait brut de concentration finale entre 0,3 et 40 mg / mL ont été mélangés dans 2 mL de solution méthanolique de DPPH à 0,002 %. L’inhibition du radical libre DPPH en pourcentage (I %) est calculée selon l’Équation (1) [9] : Inhibition (%) = [(Abscontrôle -Abstest /Abscontrôle ) x 100] (1) où, Abs désigne l’absorbance à la longueur d’onde de 517 nm. 4 Afrique SCIENCE 13(1) (2017) 1 – 12 Hery Rado RAKOTOMALALA et al. Les résultats ont été exprimés par la moyenne de 3 mesures ± écart type. La valeur d’IC50 a été mesurée pour chaque extrait. Elle peut être définie comme étant la quantité d’antioxydant requise pour diminuer la concentration du radical libre de 50 %.

Identification phénotypique de la souche représentative

La souche présentant un large spectre d’activité biologique (R212) a fait l’objet d’identification selon la méthode phénotypique. L’identification par la méthode phénotypique nécessite l’étude des différents caractères de la souche tels que les caractères culturaux, morphologiques, physiologiques et biochimiques. L’étude des caractères culturaux consiste à observer macroscopiquement l’aspect des colonies sur milieu solide. Les caractères culturaux sont déterminés sur des milieux de culture spécifiques : ISP2, ISP4, ISP5 [10], AS1A, Starch Casein agar, Nutrient agar, et le milieu Sporulation agar. Ces milieux sont ensemencés en stries à partir de l’inoculum de la souche représentative. L’importance de la croissance, le développement du mycélium de substrat et du mycélium aérien ainsi que la présence des pigments diffusibles dans la gélose autres que les pigments mélanoïdes, sur chaque milieu sont notés après 7, 14 et 21 jours d’incubation à 30°C. L’étude morphologique consiste en l’observation microscopique de la morphologie des spores, du mycélium de substrat et du mycélium aérien d’une culture de souches d’Actinomycètes sur lamelle [11]. Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en contact avec le milieu. Après 14 jours d’incubation à 30°C, la lamelle est retirée soigneusement de la gélose, déposée sur une lame et examinée au microscope à immersion à l’objectif x 100. L’étude des caractères physiologiques permet de déceler le comportement des bactéries d’Actinomycète vis-à-vis de certains facteurs de milieu. Les paramètres étudiés sont : – La température: où les cultures sont incubées pendant 21 jours à différentes températures allant de 4°C à 55°C ; – La tolérance en sel : en utilisant une gamme de concentration en NaCl de 0 % à 10 % ; – Le pH : en utilisant différents pH variant de 3,3 à 12,3; – Le type respiratoire selon le développement de la souche d’Actinomycète sur milieu VF ; – La mobilité suivant la croissance d’Actinomycète sur milieu mannitol mobilité ; – La production des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles. L’étude des caractères biochimiques permet de distinguer différents genres ou espèces d’Actinomycètes en se basant sur la différence de métabolisme. Plusieurs paramètres ont été analysés à savoir la détermination de l’équipement enzymatique de la souche d’Actinomycète[12, 13], l’utilisation de divers substrats (carbonés, protéiniques, etc.) [14] ainsi que la caractérisation des réactions cataboliques de la souche d’Actinomycète.