Déposition et réenvol de spores fongiques : contribution à la compréhension du risque nosocomial aérotransmis

Aérosolisation et sédimentation

Le nébuliseur Collison

Un nébuliseur est un dispositif capable de transformer certains liquides en un nuage de gouttelettes extrêmement fines. Il existe différentes techniques pour y parvenir, et différentes façon de les mettre en œuvre, toutes regroupées sous le même terme de nébulisation. De nombreuses applications existent comme l’humidification, la diffusion d’huiles essentielles, l’inhalation de médicaments, ou encore l’aérosolisation, qui est celle qui nous intéresse. Un terme parfois employé à la place de nébulisation est pulvérisation [141], cependant celui-ci n’est pas assez spécifique et nous ne l’emploierons pas. ll est à noter également que par le passé, les termes « atomiseur » et « nébuliseur » furent employés de façon synonyme [90], bien que le terme nébuliseur semble à présent prévaloir. En 1935, lors d’une conférence de la British Medical Association, W.E. Collison présente pour la première fois l’« inhalateur » portant son nom. Il en décrit l’utilisation dans son livre publié en 1935, Inhalation Therapy Technique, mais sans donner de détails techniques [32]. Ce dispositif est par la suite utilisé à diverses fins, et sa conception adaptée en conséquence. Il a par exemple été utilisé pendant la deuxième guerre mondiale afin de tester la perméance de filtres en y nébulisant des solutions de bleu de méthylène. En 1947, T. Rosebury décrit pour la première fois l’aérosolisation de bactéries à l’aide du dispositif de Collison [113]. En 1972, K.R. May publie un article qui fait aujourd’hui référence [90], où il décrit précisément le fonctionnement du désormais dénommé nébuliseur Collison. Il y explique comment utiliser le dispositif pour générer des aérosols de particules. Principe de fonctionnement Afin de produire de fines gouttelettes, de l’air sous pression est introduit dans le nébuliseur, de façon à produire un ou plusieurs jets de mélange air/liquide qui sont projetés à grande vitesse sur la face interne du nébuliseur. L’impact entre le jet et la surface interne produit des gouttelettes d’une large gamme de diamètres. Les plus grosses retombent dans le mélange initial, sous l’effet de leur poids, tandis que les plus fines sont entraînées hors du dispositif. Si la solution nébulisée est une suspension de particules, alors ces dernières peuvent se retrouver emprisonnées dans les goutelettes et ainsi être mises en suspension dans l’air. C’est le principe de l’aérosolisation par nébulisation. Les particules doivent pour cela être suffisamment fines, et les  L’un des premiers nébuliseurs, fabriqué par Georg Lewin’s en 1860 [32] Un nébuliseur Collison moderne à 6 jets, fabriqué par BGI Incorporated [68] gouttelettes suffisamment grosses, tout en restant assez petites pour s’échapper du nébuliseur. Afin de ne pas obtenir d’amas de particules, la concentration de la solution nébulisée doit être telle que la probabilité qu’une goutte contienne plus d’une particule soit suffisamment faible. De toutes les gouttelettes produites lors de l’impact, 25 % sont d’un diamètre inférieur à 1 µm. Parmi les gouttes d’un diamètre supérieur à 1 µm, 95 % sont d’un diamètre inférieur à 2,7 µm [90]. Il est aisé d’aérosoliser des particules d’une taille allant jusqu’à 3 µm avec un nébuliseur de type Collison, mais cela devient très difficile si la taille des particules dépasse 5 µm [71] Figure 3.1: Schéma du principe de fonctionnement du nébuliseur Collison [16]. La solution de particules est placée dans un récipient en verre. Ce récipient est refermé par un couvercle en acier inoxydable traversé par une sonde. À l’extrémité interne de la sonde se trouve une buse qui plonge dans la solution, munie d’un nombre variable d’orifices. À l’extrémité externe se trouvent deux entrées de part et d’autre d’un T. La première entrée permet d’injecter l’air comprimé dans la buse et de créer les jets qui impacteront les parois. La seconde entrée permet de connecter un manomètre afin de contrôler la pression de l’air injecté. Enfin, une sortie coudée permet aux gouttelettes assez fines de s’échapper. 

Aérosolisation de spores par voie sèche

Avantages et inconvénients L’aérosolisation à l’aide d’un nébuliseur de type Collison nécessite la mise en solution des particules à aérosoliser. Cela peut être un avantage ou un inconvénient en fonction des particules en question. Lors de nos expériences, nous avons utilisé des billes de latex de différentes tailles (de 1 µm à 10 µm). Ces billes étant vendues sous forme de solution de concentration connue, il ne restait plus qu’à les diluer pour obtenir la solution désirée. Nous avons également nébulisé des spores d’Aspergillus niger. Pour les mettre en solution, nous avons déposé une quantité donnée d’eau distillée sur des cultures sur boite de petri. Nous avons ensuite gratté la surface des cultures avant de récupérer la suspension ainsi obtenue. Pour connaître la concentration de ces solutions, nous avons procédé par dilution et culture. Le protocole de préparation de solutions de spores pour nébulisation est présenté en annexe D.1. La mise en solution préalable de spores en vue de leur aérosolisation soulève certaines interrogations. D’une part parce que cela est très éloigné de leur mode d’aérosolisation naturel, d’autre part parce que les spores d’Aspergillus sont hydrophobes [101, 3]. De plus, les spores sont projetées à haute vitesse contre les parois internes du nébuliseur, causant de violents chocs dont les conséquences éventuelles sur la viabilité, la culturabilité, ou encore la capacité à se reproduire ultérieures des spores nous sont inconnues. Signalons également que la taille des spores d’Aspergillus niger, 3,5 µm en moyenne, est un inconvénient à leur nébulisation. Nous sommes proches de la limite haute du nébuliseur et cela signifie que nous allons sélectionner les spores les plus petites. Nous ne savons pas si la taille des spores a une influence sur leur comportement ultérieur. Pour autant, le nébuliseur Collison constitue aujourd’hui une référence dans l’aérosolisation de particules et de bioparticules, notamment car il permet une bonne reproductibilité des concentrations obtenues. Signalons qu’il existe d’autres techniques, voire notamment les travaux de l’IRSN sur le bullage [123]. 3.2 Aérosolisation de spores par voie sèche En raison des inconvénients propres à notre utilisation spécifique du nébuliseur Collison, nous souhaitions nous munir d’un dispositif permettant d’aérosoliser les spores par soufflage. Après avoir essayé de procéder de façon artisanale, en dirigeant un flux d’air comprimé sur les boites de petri, s’est fait sentir le besoin de réaliser cette opération de façon contrôlée. La littérature est pléthorique quand aux méthodes d’aérosolisation de spores fongiques par soufflage direct sur des cultures sur boites de petri. Nous avons choisi de reproduire le dispositif décrit par Lee et al. en 2010 [82], en raison de sa simplicité de fabrication, nous permettant d’en réaliser nous-même un prototype, ainsi que pour les résultats prometteurs décrits. Ce dispositif consiste en un réceptacle dans lequel s’ajuste la boite de culture. Il possède en son centre une sonde permettant d’injecter de l’air sous pression. Cette sonde vient affleurer la culture fongique et est diamétralement percée de petits orifices permettant de souffler l’air tangentiellement à la surface de culture. Une ouverture excentrée permet alors aux spores de s’échapper (voir schéma 3.2 et photos 3.3). Dans la suite de l’exposé, nous l’avons nommé DAF (pour Dry Aerosolizer of Fungal spores).  Figure 3.2: Principe de fonctionnement du DAF [82] Figure 3.3: Notre prototype du DAF. L’étanchéité entre les deux parties est assurée par un joint plat. Du Téflon R en bande est utilisé pour étanchéifier les orifices filtrés de sortie et d’entrée. Dans leur article, Lee et al. [82] expliquent qu’ils parviennent à aérosoliser, en fonction de la vitesse de l’air à la sortie des orifices, des spores fongiques, des fragments fongiques (morceaux de mycélium, de conidiophores, etc.), ou un mélange des deux, comme illustré sur les diagrammes granulométriques de la figure 3.4). Ils illustrent cela par une analyse granulométrique de l’aérosol généré. On constate effectivement qu’à une vitesse inférieure à 7 m/s, le diamètre aérodynamique moyen des particules aérosolisées est de 0,4 µm, ce qui correspondrait à des fragments fongiques, tandis que pour une vitesse supérieure à 21 m/s, le diamètre aérodynamique moyen des particules aérosolisées est égal à 2,1 µm, ce qui correspond au diamètre des spores d’Aspergillus versicolor 46 3. Aérosolisation et sédimentation 3.2. Aérosolisation de spores par voie sèche utilisées pour leurs expériences, et qui sont réputées mesurer entre 2 µm et 3,5 µm [117]. Figure 3.4: Distribution de la taille des particules du bioaérosol d’Aspergillus Versicolor généré sous différentes vitesses de l’air à la sortie des buses : (a) 7 m/s, (b) 14 m/s, (c) 21 m/s et (d) 35,4 m/s [82] Nous avons reproduit l’expérience en utilisant des spores d’Aspergillus niger. Connaissant le débit volumique D à l’entrée de l’aérosoliseur ainsi que le diamètre des buses (1 mm), au nombre de huit, nous en avons déduit la vitesse V en sortie des buses : V = D 8.πr2 ⇒ V [m.s−1 ] ‘ 0, 66 D [l.min−1 ] Le DAF a été placé dans une cuve en PMMA (Plexiglas) étanche à l’air avec une une ouverture munie d’un filtre HEPA. L’air injecté était séché à l’aide d’un dessiccateur sous la forme d’un tube de cinq centimètres de diamètre et trente centimètres de longueur, rempli de billes de gel de silice. Nous avons mesuré le débit à l’aide d’un débitmètre Sho-Rate. Nous avons mesuré la concentration particulaire de l’aérosol à l’aide d’un compteur particulaire portable à diffusion 47 3.3. Sédimentation de particules 3. Aérosolisation et sédimentation Handilaz (Particle Measuring Systems). La taille moyenne des spores d’Aspergillus se situant aux alentours de 3,5 µm, nous avons considéré que le canal 1 µm – 5 µm du compteur particulaire représentait la quantité de spores aérosolisée. Les résultats de ces mesures sont présentés figure 3.5. Nous n’avons pas reproduit le résultat obtenu par Lee et al. [82], à savoir générer en fonction de la vitesse de l’air un aérosol de spores, de fragments fongiques, ou un mélange des deux. Nous ne générons, quelle que soit la vitesse de soufflage, qu’un aérosol de spores. Une piste d’explication possible est que nous avons travaillé avec l’espèce niger au lieu de l’espèce versicolor, dont les spores sont de taille légèrement inférieure, mais nous nous attendions à des résultats au moins similaires, à la vitesse près. Malgré cela, le DAF à notre besoin premier qui est d’aérosoliser des spores fongiques sans avoir à les mettre en solution. Il présente également quelques inconvénients. Tout d’abord, il produit des concentrations de spores extrêmement élevées, bien trop importantes pour les cuves dans lesquelles nous avons réalisé les expériences qui vont être décrites par la suite. Nous avons dû pour y remédier filtrer l’aérosol produit en sortie. De plus, et c’est l’inconvénient majeur, nous avons eu des difficultés importantes à obtenir une reproductibilité acceptable de la concentration de l’aérosol généré ; elles peuvent s’expliquer par la difficile reproductibilité des croissances sur boites de petri. Nous soupçonnons également un biais introduit par la température des boites, selon qu’elles viennent d’être sorties de l’étuve, du réfrigérateur, ou de l’ambiant, mais nous n’avons pas réussi à le confirmer expérimentalement. 3.3 Sédimentation de particules La sédimentation de particules, ainsi que le comportement des bioaérosols, sont des sujets largement traités dans la littérature scientifique. Pour un exposé complet, le lecteur pourra se reporter aux ouvrages de référence de Cox & Wathes [37] et Hinds [59]. Nous allons présenter quelques résultats qui seront des outils utiles pour la suite de l’exposé. Vitesse de sédimentation Lorsqu’une particule est en suspension dans l’air, elle est soumise à l’influence de son propre poids et va sédimenter, pour peu que l’air soit au repos. Passé un régime transitoire, la particule atteint une vitesse constante, lorsque la force de traînée FD est égale à la force d’attraction gravitationnelle FG (une description de la force de traînée est donnée au chapitre 7.2). FD = FG Si l’on se place dans le cas de petites particules sphériques se déplaçant à faible vitesse (écoulement de Stokes), la force de traînée peut être approximée comme suit : FD = 3π · µ · dp · VS (Loi de Stokes) (3.1) µ est la viscosité dynamique du fluide, dp est le diamètre de la particule, et VS est la vitesse relative de la particule par rapport au fluide, ou vitesse de sédimentation. Les hypothèses exactes pour pouvoir appliquer la loi de Stokes sont que l’écoulement est incompressible, qu’il n’y a pas de parois ou de particules à proximité de la particule, que cette dernière est une sphère rigide, que 48 3. Aérosolisation et sédimentation 3.3. Sédimentation de particules Figure 3.5: mesures granulométriques obtenues lors de l’aérosolisation par voie sèche de souches d’Aspergillus niger, en fonction de la vitesse de l’air à la sortie des orifices. La quantité de spores aérosolisées est représentée en unité arbitraire. son déplacement se fait à vitesse constante, et que la vitesse de l’air à la surface de la particule est nulle. La force d’attraction gravitationnelle s’exprime quand à elle comme suit : FG = π · (ρp − ρf ) · g · d 3 p 6 (3.2) g est l’accélération de la pesanteur, ρp est la densité de la particule et ρf est la densité du fluide. Cette dernière est incluse pour tenir compte de la flottabilité, mais peut dans la plupart des cas être négligée. Par exemple, dans le cas d’une goutte d’eau dans de l’air, le ratio des densités est égal à 800, et négliger la flottabilité induit une erreur de seulement 1 %. Les équations (3.1) et (3.2) nous donnent alors : VS = ρp · g · d 2 p 18 · µ (3.3) C’est l’équation de sédimentation de Stokes. Sous cette forme, elle est suffisamment précise (±10%) pour déterminer la vitesse de sédimentation de particules de densité unitaire de diamètres pouvant aller de 1,5 à 75 µm [59]. Facteur de correction de Cunningham Une hypothèse nécessaire à l’établissement de la loi de Stokes est la condition de non glissement : la vitesse de l’air à la surface de la particule est nulle. Cette hypothèse n’est plus vérifiée si les particules sont suffisamment petites pour avoisiner le libre parcours moyen du fluide. La vitesse de l’air à leur surface n’est pas nulle : il existe un glissement. C’est le cas lorsque les particules sont d’un diamètre inférieur à 1 µm. De telles particules sédimentent plus vite que ce que prévoit l’équation (3.3). En 1910, Ebenezer Cunningham (1881 – 1977) propose un facteur de correction de la loi de Stokes afin de tenir compte de ce glissement. Ce facteur est appelé facteur de correction de Cunningham, noté CC . Il dépend du libre parcours moyen λ des molécules du fluide. CC = 1 + 2, 52λ dp (3.4) λ = 1 π · √ 2 · n · d 2 m (3.5) n est le nombre de molécules par unité de volume du fluide, et dm est le diamètre de collision des molécules, c’est à dire la distance entre les centres de deux molécules à l’instant de la collision. Pour de l’air, à la pression de 101 kPa (1 atm) et à la température de 293 K (20˚C), le libre parcours moyen est égal à 0,066 µm. Le facteur de correction de Cunningham est toujours plus grand que 1 et réduit la force de trainée de la loi de Stokes : FD = 3π · µ · dp · V CC (3.6) Son utilisation étend le champ d’application de la loi de Stokes jusqu’aux particules d’un diamètre inférieur à 0,1 µm. Ce champ peut être étendu d’avantage grâce à des équations empiriques basées sur des mesures expérimentales du glissement. Son expression devient alors : CC = 1 + λ dp [2, 34 + 1, 05e −0,39 d λ ] (3.7) 50 3. Aérosolisation et sédimentation 3.3. Sédimentation de particules Il est alors appelé « facteur de correction du glissement » (slip correction factor en anglais). L’équation déterminant la vitesse de sédimentation corrigée s’écrit : VS = ρp · g · d 2 p · CC 18µ (3.8) Elle est alors valide pour une large gamme de tailles de particules, allant de particules nanométriques à des diamètres pouvant s’élever jusqu’à 50 µm [59]. En effet, rappelons que nous avons fait au départ l’hypothèse d’un écoulement de Stokes, et donc de petites particules se déplaçant à faible vitesse. Pour une particule de 1 µm de diamètre et de densité 1000 kg ·m−3 , aux conditions standard, le facteur de correction du glissement vaut 1,15. Cela signifie que la particule sédimente 15 % plus vite que ce qui aurait été prédit par l’équation non corrigée. Pour des applications numériques précises, il convient d’utiliser ce coefficient pour des tailles de particules allant jusqu’à 10 µm.