Étude de la reproduction sexuée

Reproduction sexuée 

La reproduction sexuée par confrontation, arrosage, dicaryon/tricaryon se fait sur milieu PDA. Les boîtes sont ensuite incubées à 24 °C avec une alternance de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité après inoculation. En confrontation, les souches sont ensemencées en ligne l’une en face de l’autre, avec environ 1,5 cm entre les deux souches. Chaque ligne contient de quatre à six inocula de la même souche provenant soit d’une boîte de conidies soit d’un cryotube. En arrosage, la souche mâle, donneuse de conidies est ensemencée sept jours avant arrosage et incubée à 30 °C à la lumière pour favoriser la production de conidies. Trois jours avant arrosage, la souche femelle est inoculée et incubée à 24 °C à l’obscurité. Le jour de l’arrosage, 4 ml d’eau stérile sont déposés sur la souche mâle et les conidies sont récoltées à l’aide d’un râteau. Les conidies sont comptées et leur concentration ajustée entre 103 et 108 conidies/ml. La souche femelle est arrosée avec 1 ml de conidies réparties uniformément sur toute la boîte à l’aide d’un râteau. Pour faire un dicaryon ou un tricaryon, les souches sont incubées séparément deux jours à 30 °C à l’obscurité pour éviter la formation de conidies. Un implant d’agar de 0,5 cm sur 0,5 cm de chacune des souches impliquées (deux pour dicaryon et trois pour un tricaryon) est découpé et placé dans un tube Eppendorf de 2 ml contenant 500 µL d’eau stérile. Les mycéliums sont mixés à l’aide du FastPrep®-24 (MP Biomedicals) pendant 20 s à une vitesse de 4 m/s et 10 µL du broyat sont déposés sur PDA. 

Observation du cycle de reproduction sexuée

 Trois séries de quatre boîtes du même croisement sont initiées à deux jours d’intervalle les uns des autres selon la méthode décrite au paragraphe 

Tous les jours, les boîtes des croisements sont prises en photos à l’aide du scanner HP Scanjet G2710

 Des prélèvements des structures (mycélium et stromata) apparaissant au fil de la cinétique sont effectués sur deux des quatre boîtes. L’agar contenant le mycélium est découpé, et le mycélium est coloré au Bleu-Lactophénol (Merck) puis observé à l’aide du microscope AxioImager M2p Carl Zeiss portant les objectifs N-Achroplan 40X et N-Achroplan 100x/1.25 Oil Iris M27 (Carl Zeiss) et les images ont été prises à l’aide de la caméra Axiocam 105 Color (Carl Zeiss). Les stromata à différents stades sont observés à l’aide de la loupe binoculaire Leica S8 APO qui permet un grossissement x10 à x80. Les images sont prises à l’aide de la caméra Leica 69 MC170 HD et traitées à l’aide du logiciel Leica Application Suite (LAS). Les coupes de stromata sont effectuées à l’aide de scalpel et de lame de rasoir. 

Test MAT 

Le test MAT permet de définir le type sexuel d’une souche. La souche à tester est inoculée 6 fois en ligne au milieu de la boîte de Petri. À chacun des deux pôles de la boîte sont inoculées la souche MAT1-1 d’un côté et la souche MAT1-2 de l’autre. La boîte est incubée à 24 °C avec une alternance de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité. Il y aura production de stromata à la confrontation de la souche testée avec une des deux souches « test » et par déduction, la souche testée est du type sexuel opposé à celui de la souche « test » avec laquelle elle se croise. La validation moléculaire des types sexuels s’effectue par l’amplification d’un fragment interne de 1 kb pour le locus MAT1-1 avec le couple d’amorces MAT1-1-F interne et MAT1-1-R interne (Tableau 6) ou d’un fragment de 500 pb pour le locus MAT1-2 avec le couple d’amorce MAT1-2-F interne et MAT1-2-R interne (Tableau 6). 

Obtention de descendants isolés à partir d’ascospores

 Le milieu Agar-H2O est utilisé pour la germination des ascospores et se compose de 15 g/L d’agar (VWR chemicals BDH Prolabo). Les ascospores expulsées sur le couvercle de la boîte de Pétri sont récupérées par rinçage avec la solution CTS50. Elles sont comptées à l’aide de la cellule de Malassez puis diluées pour qu’environ 30 à 50 ascospores soient étalées sur le milieu de germination, afin de faciliter la récupération des thalles. Les boîtes de Petri sont incubées à 30 °C à la lumière pendant 48 h minimum, jusqu’à apparition des colonies isolées. Puis les thalles isolés sont récupérés en découpant le morceau d’agar qui les contient l’aide d’une plume. Chaque thalle est repiqué sur PDA et incubé à 30°C jusqu’à l’apparition de conidies, puis purifié comme décrit plus bas (chapitre 2.5.2.3) et repiqué sur PDA.

Test de viabilité des ascospores 

Les ascospores expulsées sur le couvercle de la boîte de Petri sont récupérées par rinçage avec la solution CTS50. Elles sont comptées, ajustées à une concentration de 1.106 cellules/ml et conservées dans des cryotubes à 4 °C, -20 °C et -80 °C (trois tubes par température et par temps). Le jour de la récolte puis après deux semaines, un mois et six mois de stockage, 2, 20 et 200 ascospores sont mises à germer sur milieu Agar-H2O. Après 48 h d’incubation les colonies sont comptées. Chaque expérience est réalisée en triplicat. 70 2.3.6. Test d’incompatibilité végétative Le protocole utilisé pour visualiser l’incompatibilité végétative par mort cellulaire est adapté de celui de Silar (2005). Les souches entre lesquelles le test d’incompatibilité végétative est effectué sont inoculées l’une en face de l’autre puis incubées à 30 °C à la lumière pendant 3 à 4 jours jusqu’à ce qu’elles entrent en confrontation. Puis, elles sont mises en contact avec 3 ml d’une solution de Bleu de trypan 0,05 % répartie de façon homogène à l’aide d’un râteau. La boîte de Petri est ensuite incubée pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur à mouvement circulaire. Après incubation, le colorant est éliminé et la boîte de Pétri rincée à l’eau claire toutes les 10 min jusqu’à ce qu’apparaisse clairement une bande bleu foncé correspondant aux cellules mortes ou que l’eau de rinçage soit limpide.

Observation des anastomoses

Les souches à observer sont inoculées sur milieu Agar-H2O et incubées à 30 °C à l’obscurité. Le mycélium obtenu est repiqué deux fois de suite sur milieu Agar-H2O pour obtenir un mycélium grêle. Enfin il est repiqué sur milieu Agar-H2O recouvert d’une feuille de cellophane (Biorad) et incubé à 30 °C à l’obscurité jusqu’à ce qu’il fasse quelques centimètres. Le jour de l’observation, la feuille de cellophane est découpée, et colorée avec la solution de Lactophénol-Blue (Lactophenol Cotton Blue Solution, Lactophenol Aniline Blue Solution -Sigma) diluée au demi. Les anastomoses sont observées à l’aide du microscope AxioImager M2p Carl Zeiss portant les objectifs N-Achroplan 40X et N-Achroplan 100x/1.25 Oil Iris M27 (Carl Zeiss) et les images ont été prises à l’aide de la caméra Axiocam 105 Color (Carl Zeiss).

Élaboration du plan d’expérience 

Le plan d’expérience a été établi à l’aide du logiciel Design-Expert® Version 9. Les quatre facteurs sélectionnés pour l’étude sont la souche femelle (2 possibilités), la luminosité (3 possibilités), la durée de pré-incubation avant arrosage (3 niveaux) et la concentration de conidies utilisée pour l’arrosage (4 niveaux). Les différentes valeurs à tester pour chacun de ces facteurs sont résumées dans le paragraphe 3.1.4. La réponse est modélisée en utilisant un modèle quadratique, comprenant les effets principaux des quatre facteurs (4 termes), les effets d’interactions des facteurs 2 à 2 (6 termes), ainsi qu’un terme polynomial pour la concentration de conidies (1 terme). D’après le logiciel, 21 expériences au minimum sont nécessaires pour identifier les 11 termes du modèle. Dix-neuf expériences, dont des expériences en duplicata, ont été ajoutées pour améliorer la robustesse du modèle, et calculer sa précision. L’analyse statistique des résultats expérimentaux a été réalisée avec le même logiciel. 

Transformations

Transformation bactérienne

 Les cellules compétentes (DH5α, Top10, 10-beta) utilisées ont été achetées auprès de New England Biolabs (NEB). 50 µL de cellules sont mis en contact avec 1 à 5 µL de plasmide (soit 1 à 100 ng d’ADN). Le tube réactionnel est placé dans la glace pendant 30 minutes. La transformation se fait par un choc thermique à 42 °C pendant 30 secondes. Les cellules sont ensuite remises dans la glace pour 5 minutes. Une phase de régénération permet ensuite au gène de résistance de s’exprimer. Pour cela les cellules sont reprises dans le milieu SOC (950 µL) fourni et incubées 1 h à 37 °C avec une agitation de 225 rpm. 100 µL sont ensuite étalés sur milieu gélosé LB contenant l’antibiotique nécessaire à la sélection des clones ayant intégré le plasmide. Après une incubation à 37 °C sur la nuit, les colonies sont repiquées. Des PCR sur colonies sont ensuite réalisées pour vérifier la présence du gène d’intérêt. Les colonies portant le gène désiré sont alors mises en culture liquide en vue d’une extraction d’ADN plasmidique. 

Transformation fongique par la méthode des protoplastes 

Préparation des protoplastes 

Les fioles de Roux contenant 200 mL de milieu Potato Dextrose ou PD (Difco Laboratories USA) sont ensemencées avec 200 µL de conidies et incubées à 30 °C durant 4 jours. Le mycélium est récupéré par filtration sur gaze et incubé à 37 °C dans du tampon KPam ((NH4)2SO4 à 0,6M, KH2PO4 à 25 mM, pH 5,8). Le mélange est à nouveau filtré et incubé 2 h 30 à 37 °C dans du KPam contenant 30 mg/mL de Glucanase (novozymes). Après digestion, les protoplastes sont filtrés sur du verre fritté et de la gaze. Le mélange est réparti dans 4 tubes corex et centrifugés 5 min à 4000G à 4°C. Les 4 culots sont suspendus dans du CTS-10 (27,4 g/l saccharose ; 0,1 M Tris HCl pH 7,5 ; 10 mM CaCl2) et centrifugés. Les 4 culots obtenus sont réunis dans deux tubes qui sont centrifugés à nouveau. Les 2 nouveaux culots sont réunis dans un seul tube et recentrifugés. Les protoplastes obtenus sont suspendues dans du CTS-50 (137 g/l saccharose ; 0,1 M Tris-Hcl pH 7,5 ; 50 mM CaCl2) afin d’obtenir une concentration de 2.108 protoplastes/mL et sont conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation. 

Transformations des protoplastes

5 µL d’ADN sont additionnés à 45 µL des protoplastes et le mélange est incubé 10 min à température ambiante. Après addition de 500 µL de PEG (60 % polyéthylène glycol 4000 ; 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ; 50 mM CaCl2), on incube à nouveau 20 min à température ambiante avant d’ajouter 72 450 µL de CTS50. Ce mélange est additionné de 40 mL de PDA en surfusion contenant 0,8 M de saccharose et de l’antibiotique adéquat puis coulé sur boîtes de sélection PDA. Les boîtes de transformation sont incubées 3 jours à 30 °C.