MATERIELSET METHODES
Etudes phytochimiques
Préparation de l’extrait brut ou extrait hydroalcoolique (EHA)
Les feuillesde Leea guine en si sont été collectées le mois d’août 1995 dans la région de Manongarivo. Six cent grammes de poudre de feuilles de Leea guineensis ont été macérés dans 4l d’un mélange éthanol-eau (50 : 50) pendant 48 heures à la température ambiante. Après filtration, le résidu a été repris avec le même volume du même mélange de solvants pendant 48 heures. Le mélange a été filtré, puis traité une troisième fois avec 4l du mélange dans les mêmesconditionsque précédemment.
Après filtration, les trois filtrats ont été mélangés et évaporés sous pression à l’aide d’un évaporateur rotatif (ROTAVAPOR : Buchi type W 240). L’extrait aqueux ainsi obtenu a été lyophilisé pour obtenir l’extrait brut.
Le protocole montrant la préparation de l’extrait brut est rapporté sur le Schéma1.
Criblagephytochimique
Cette manipulation a pour but de déterminer la présence de différentes familles chimiques contenues dans l’extrait brut. La méthode utilisée lors de ce criblage est basée sur la formation de complexes insolubles (réaction de précipitation) ou sur la formation de complexes colorés ( réaction de coloration ) en présence de différents réactifs chimiques spécifiquespour chaque famillechimique(FONG etcoll.,1977).Tableau II.
Tests biologiques
Extraitsadministrés
Pour chaque expérience, l’extrait a été dissout dans de l’eau distillée lorsqu’il a été administré par voie orale et dans du sérum physiologique ( NaCl 9% ) quand l’administration a été effectuée parvoie sous-cutanée.
Animaux
Des souris de race SWISS, sans distinction de sexe, pesant entre 20 et 30 grammes ont été utilisés pour l’étude de la toxicité, de l’activité anti-inflammatoire, de l’activité analgésique et de la perméabilité capillaire de l’extrait. Par contre, pour étudier l’activité antipyrétique de l’extrait et de la tolérabilité gastrique, des rats de raceWISTAR de deux sexes pesant entre 180 et 200 gramme sont été utilisés.
Les animaux ont été mis à jeun 24 heures avant chaque expérience, mais ont eu accès libre à l’eau.
Test sur l’augmentation de la perméabilité capillaire provoquée par l’acide acétique
Dans le processus inflammatoire, la perméabilité capillaire augmente. Cette propriété a été mise à profit pour mettre en évidence l’activité de l’EHA de la plante sur les capillaires.
Dix lots de 10 souris ont été utilisés : un lot témoin recevant de l’eau distillée est utilisé à chaque produit à tester. Deux autres lots ont reçu l’EHA aux doses de 1000mg/kg et 500mg/kgetles troisderniers lots ontreçu lesproduits de référence :l’indométacine5mg/kg, la phénylbutazone 100mg/kg et l’acide acétylsalicylique 300mg/kg (AHMED et coll., 1993 ; SINGH et coll.,1997 ;IVANOVSKA etcoll.,1997).
Trente minutes après administration orale des produits à tester, une solution de bleu d’Evans à la concentration de 0.5% dans du sérum physiologique a été injectée dans la veine caudale de l’animal à raison de 10mg/kg de poids corporel. Quinze minutes après l’injection de ce colorant, une solution d’acide acétique à 0.6% a été injectée par voie intra-péritonéale à raison de 10ml/kg. Après 30mn, les animaux ont été sacrifiés et disséqués puis leur cavité abdominale a été rincée avec 4ml de NaCl contenant 500UI d’héparine ; l’eau de rinçage a été quantitativement collectée puis centrifugée à 1500 tpm pendant 10mn. La concentration en bleu d’Evans dans le surnageant a été déterminée par colorimétrie à l’aide d’un spectrophotomètre (JENWAY MODELS 6400/6405) à la longueur d’onde λ égale à 610nm (WHITTLE,1964 ;MENEZESetcoll.,1990 ; SINGH et coll.,1997).
L’activité inhibitrice de l’EHA de Leea guineensis a été exprimée en pourcentage d’inhibition de la perméabilité capillaire chez les sujets traités par rapport aux témoins selon la formule :
Etudede l’activité anti-inflammatoire de l’EHA de Leea guineensis
Pour déterminer les propriétés anti-inflammatoires de l’extrait, des modèles d’inflammation expérimentale aiguë, subchronique,et chronique ont été utilisés. Les produits de référence utilisés pour chaque étude sont les mêmes à savoir : l’indométacine (IND), l’acide acétylsalicylique (ASA) et la phénylbutazone (PNB) mais à doses différentes selon les modèles d’inflammation (SAXENA et coll., 1984 ; AHMED et coll., 1993 ; SINGH et coll.,1997).
Inflammation expérimentale aiguë
Doses administrées
Sept lots de 10 souris ont été utilisés pour l’étude de l’inflammation expérimentale aiguë. Un lot témoin a reçu de l’eau distillée par voie orale, 3 lots ont reçu l’EHA de Leea guineensis par la même voie aux doses de 250mg/kg ; 500mg/kg et 1000mg/kg. Les 3 derniers lots ont reçu les produits de référence qui ont été l’IND 10mg/kg, l’ASA 300mg/kg et la PNB 100mg/kg (AHMED et coll., 1993 ; SARITA et coll., 1993 ; SINGH et coll., 1997).
Provocationde l’inflammationaiguë
Pour provoquer l’inflammation aiguë, 50µl de suspension de λ carragénine à 1% ont été injectée dans la voûte plantaire de la patte postérieure droite (WINTER, 1962 ; SINGH et coll., 1989 ; FLEURENTIN et coll., 1997). Cette injection a été faite 30minutes après administrationde l’extrait.
Mesures de volumede pattes
Les volumes des pattes des souris ont été mesurés avec un pléthysmomètre (UGOBASILE). Les mesures ont été faites juste avant et après injection de l’agent phlogogène,puis 1 heure et3 heures après cette injection.
Inflammation expérimentale sub chronique
Doses administrées
Pour cette étude, 6 lots de 10 souris ont été utilisés. Un lot témoin a reçu de l’eau distillée par voie orale ;2 lots ont reçu l’extraitaux doses de 500mg/kget1000mg/kg. Les 3 lots restant sont reçu par la même voie les produits de référence :IND 5mg/kg, PNB 100mg/kg, ASA 500mg/kg (SAXENA et coll., 1984 ; AHMED et coll., 1993 ; ZARZUELO etcoll.,1993 ; SINGH et coll.,1997).
Provocation de l’inflammation subchronique
Pour provoquer l’inflammation subchronique, une boule de coton pesant 10mg, imbibée de carragénine 1% (p/v) préparée avec du sérum physiologique a été introduite dans la région inter scapulaire des souris. (BASILE et coll., 1988 ; AHMED et coll., 1993 ; SINGH et coll., 1997). Le traitement a duré sept jours pendant lesquels les différents lots ont reçu la même dose, par la même voie et à la même heure.
Mesures de l’augmentationdepoids du coton
Au huitième jour, les animaux ont été sacrifiés et disséqués. Le granulome ainsi formé a été prélevé,séché pendant 2 heures dans une étuve réglée à 60°C puis pesé. Un lot de 10 boules de coton imbibé de carragénine, servant de référence, a été séché et pesé de la même manière que précédemment. L’augmentation de poids du coton a été mesurée selon la formule suivante :
Inflammation expérimentale chronique
Doses administrées
Pour étudier l’activité de l’extrait sur l’inflammation chronique, 6 lots de 10 souris ont été utilisés dont 1 lot témoin qui a reçu de l’eau distillée. Les 2 autres lots ont reçu par voie orale 500mg/kg et 1000mg/kg de l’extrait brut. Les 3 derniers lots ont reçu les produits de référence : l’IND 1.5mg/kg ;l’ASA 250mg/kg ; et la PNB 100mg/kg (SAXENA et coll., 1984 ; BASILE etcoll.,1988 ; SINGH et coll.,1997).
Provocation de l’inflammation chronique
Pour provoquer l’inflammation chronique, 0.03ml d’adjuvant de Freund Complet (AFC ) 0.5% a été injecté dans la région plantaire de la patte postérieure droite de la souris. L’administration de l’extrait a débuté 24 heures avant la provocation de l’inflammation. (NEWBOULD, 1963 ;SAXENA etcoll.,1984 ; SINGH et coll.,1997 )
Mesures de volumes de pattes
Les volumes de pattes des souris ont été mesurés juste avant l’injection de l’adjuvant et13 jours après.
Analysesdes résultats
Pour l’inflammation expérimentale aiguë et chronique,l’activité anti-inflammatoire de l’EHA de la plante a été exprimée en pourcentage d’inhibition du volume de l’œdème obtenu, selon la formule :
Etude de l’activité analgésique de l’extrait brut
Douleur provoquée par l’injectionintra-péritonéale d’acide acétique (writhingtest)
L’administration d’acide acétique à 0.6% par voie intra- péritonéale entraîne l’apparition des mouvements de contraction de l’abdomen, d’étirement et de contorsion périodique du tronc et d’extension des pattes postérieures chez la souris (VOURC’H, 1971 ; LANRHENS et coll.,1991). Sept lots de 10 souris ont été utilisés ; 1 lot témoin a reçu de l’eau distillée par voie orale et 3 lots ont reçul’extraitbrut à des doses différentes : 250mg/kg,500mg/kg,1000mg/kg.
Les 3 dernierslots ont reçules produits deréférence : l’IND 5mg/kg,l’ASA 250mg/kg,et la PNB 100mg/kg (SAXENA et coll., 1984 ; SANTOS et coll., 1997 ; HAJARE et coll., 2000)
Trente minutes après leur administration, une solution d’acide acétique à 0.6% a été injectée par voie intra- péritonéale à raison de 10ml/kg de poids corporel chez la souris. Le comptage du nombre de contractions abdominales a commencé juste après cette injection et a été effectué toutes les 5 minutes pendant 20 minutes. L’activité inhibitrice de l’EHA de la plante a été exprimée en pourcentage d’inhibition de la contraction abdominale chez les sujets traités par rapportau témoinselon la formule :
Douleur provoquée par la chaleur(hotplate)
La méthode de la plaque chauffante a été décrite initialement pour la souris par WOOLFE et Mac DONALD (1944). Elle consiste à provoquer un stimulus thermique chez cet animal en le déposant sur une plaque métallique (PANBAL 475) chauffée à une température égale à 45°C. Les réactions objectives de l’animal étant successivement l’agitation, le léchage des pattes antérieures, le redressement sur les pattes postérieures et le saut en dehors. Le temps nécessaire à l’animal pour fuir et sauter en dehors de la plaque chauffante constitue le seuil de tolérance de l’animal face à la chaleur.
Six lots de 10 souris ont été utilisés.Un lot témoin a reçu de l’eau distillée par voie orale ; 2 autres lots ont reçu l’extrait brut aux doses de 1000mg/kg et 500mg/kg ; les 3 derniers lots ont reçu les produits de référence : l’IND 10mg/kg,l’ASA 50mg/kget la PNB 100mg /kg) (LANRHENS et coll.,1991 ;AHMED et coll.,1993 ;HAJAREet coll.,2000).
La mesure a commencé 30 minutes après l’administration orale de l’extrait et a été effectuée toutes les 5 minutes pendant 20 minutes.
Etude de l’activité antipyrétique de l’extrait brut
Cinq lots de 6 rats ont été utilisés. Un lot témoin a reçu de l’eau distillée par voie orale ; les 3 autres lots ont reçu l’extrait brut aux doses de 1000mg/kg, 500mg/kg et 250mg/kg. Le dernier lot a reçu l’ASA 200mg/kg comme produit de référence (IKRAM et coll., 1987 ; HAJARE et coll., 2000). L’augmentation de la température corporelle a été provoquée selon la méthode décrite par LOUX et coll.(1972) ; KHATTAK et coll.(1985) ; URBINA et coll.(1988) ; HAJARE et coll.(2000) : une suspension de levure de bière 12% (p/v) dans du sérum physiologique a été injectée par voie sous-cutanée dans la région dorsolatéraleà raison de1ml/100gde poids corporel.
La température rectale de l’animal a été mesurée avant administration de l’extrait puis 1, 2 et 3 heures après administrationdel’extrait,avecun thermomètreélectronique(PHILIPS)
L’activité antipyrétique de l’extrait a été exprimée en pourcentage d’inhibition de l’augmentation de la température expérimentale selon la formule suivante :
Test de toxicité
Toxicité aiguë
Pour évaluer la toxicité aiguëde l’extrait,les animaux ont été répartis en 4 lots de 6 souris. Les animaux du lot témoin n’ont reçu que de l’eau distillée tandis que les trois autres lots ont reçu chacun, par voie orale, une seule dose d’extrait de Leea guineensis : 1.5g/kg, 2g/kg, 3g/kg.
Les signes d’intoxication ainsi que le taux de mortalité ont été observé à 5, 15, 20 minutes et à 1, 2, 4, et 6 heures après l’administration de l’extrait (MALONE et coll., 1991). Ensuite, ils ont été observés une fois par jour jusqu’au septième jour. Pendant cette seconde période, les animaux ont été nourris avec la provende Feedmil221 et ont eu accès libre à l’eau.
Toxicité gastrique
Deux lots de 3 rats ont été utilisés pour étudier la toxicité de l’extrait de Leea guineensis sur la muqueuse stomacale. Le premier lot est un lot témoin et a reçu de l’eau distillée, alors que le second est un lot traité et a reçu tous les matins à 8 heures, 3g/kg d’extrait de Leea guineensispendant2 jours.
Trois jours après l’administration de l’EHA, les animaux ont été sacrifiés, puis leur estomac ont été prélevé, ouvert tout au long deleurgrandecourbure.Les estomacsontétédébarrassés et lavés des restes de leur nourriture avant de les examiner et de noter le nombre et les types de lésions provoqués par l’extraitselonles indicesd’ulcères ( DOLLARD, 1989) suivant :
0 : pas de lésionmacroscopiquevisible
1 : hyperhémiede la muqueusegastrique
2 : présenced’un à dix ulcèrespunctiformes
3 : plus de dixulcères punctiformesou un à deux ulcèresélongés
4 : plus de deuxulcères élongés
5 : ulcèreperforé
Analysedes résultats
Pour comparer les moyennes des résultats obtenus, un test « t » de Student a été utilisé.La valeur dep>0.05 a été considérée comme non-significative.
RESULTATS
Phytochimie
Après évaporation à sec et lyophilisation, l’extraction par mélange éthanol- eau : 50-50 (v/v) a donné un rendementégal à 19.33%.
Les résultats du criblage phytochimique de l’extrait hydroalcoolique (EHA) sont résumés dans le TableauIII.
Effet inhibiteur de l’EHA sur l’augmentation de la perméabilité capillaire provoquée par l’acideacétique 0.6%.
La perméabilité capillaire expérimentale diminue en fonction de la dose administrée.Aladosede 500mg/kg,cette diminution est de 18.43 ±1.93 % et atteint 44.26 ±2.33 % à la dose de 1000mg/kg.
Les produits deréférence présentent une activité inhibitrice respectivement égale à 45.47 ± 2% (n =10) ;43.73 ±2.5 % (n = 10) et13.15 ± 1.31% (n =10) pour l’IND 5mg/kg, la PNB 100mg/kgetl’ASA 300mg/kg(Figure1).
Effet sur l’inflammation expérimentale aiguë
Trois heures après la provocation de l’inflammation, l’EHA de Leea guineensis diminue les volumes des œdèmes. Cette diminution varie en fonction de la dose administrée. Aux doses respectives de 250, 500 et 1000mg /kg,les volumes des oedèmes réduisent de 35.3 ± 3.6 % (n =10) à 60.3 ± 5.1 % (n =10) puis à 67 ± 3.9 % (n =10). L’EHA de Leea guineen sis à la dose de 1000mg/kg provoque le même effet que l’IND 10mg/kg ; la diminution des volumes des œdèmes est de70.1 ±4.9 % (n = 10) contre67.3 ± 3.5 % (n =10) et cette différence est statistiquement non significative. Pour le PNB 100mg/kg et ASA 300mg/kg, la réduction des volumes des oedèmes est respectivement de 89.72 ± 2% (n = 10) et 71.57 ± 5% (n = 10) (Figure2).
Table des matières
TABLE DES MATIERES
LISTES DES FIGURES
LISTES DES TABLEAUX
LISTES DES PHOTOGRAPHIES ET SCHEMAS
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
A- ETUDE SPHYTOCHIMIQUES
I- Préparation de l’extrait brut
II- Criblagephyto chimique
B- TESTS BIOLOGIQUES
I- Extraits administrés
II- Animaux
III- Test sur l’augmentation de la perméabilité capillaire provoquée par l’acideacétique
IV- Etude de l’activité anti-inflammatoire de l’extrait brut de Leea guineensis
1-Inflammation expérimentale aiguë
2-Inflammation expérimentale sub chronique
3-Inflammation expérimentale chronique
V- Etude de l’activité analgési que de l’extrait brut de Leeaguineensis
1-Douleur provoquée par l’injectionintra-péritonéale d’acide acétique
2-Douleur provoquée par la chaleur
VI – Etude de l’activité antipyrétique de l’extrait brut de Leeaguineensis
VII- Test de toxicité
1. Toxicité aiguë
2. Toxicité gastrique
VIII – Analyse des résultats
RESULTATS
A- PHYTOCHIMIE
B – TESTS BIOLOGIQUES
I – Activité anti-inflammatoire de l’extrait brut de Leea guineensis
1 -Effet sur l’augmentation de la perméabilité capillaire
2 -Effet sur l’inflammation expérimentale aiguë
3 -Effet sur l’inflammation expérimentale subchronique
4- Effet sur l’inflammation expérimentale chronique
II- Activité analgésique de l’extrait brut de Leeaguineensis
1 -Effet sur la douleur provoquée par l’acide acétique
2- Effet sur la douleur provoquée par la chaleur
III – Effet sur l’augmentation de la température provoquée par la levure de bière12%
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
