ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES ECORCES DE CARAPA PROCERA

Chromatographie sur colonne

Alors que les autres méthodes chromatographiques sont habituellement employées pour l’analyse et la séparation de très faibles quantités de produits, la chromatographie sur colonne, elle, permet, la séparation des constituants d’un mélange et leur isolement, à partir d’échantillons dont la masse peut atteindre plusieurs grammes. Elle présente cependant plusieurs inconvénients: • de grandes quantités de solvant sont nécessaires à l’élution 55 • la durée de l’élution est généralement très grande • la détection des composés exige une attention constante. Elle est adaptée à la purification de quelques grammes de produit, lorsque les conditions opératoires sont au point. Cependant, la méthode étant très empirique, sa mise au point nécessite souvent de nombreux essais. IV.6.1Description et principe C’est une technique basée sur des phénomènes d’adsorption. La phase solide, le plus souvent l’alumine ou la silice, remplit une colonne de longueur et de section variables. L’échantillon, en solution concentrée, est déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de l’écoulement continu d’un éluant, traversant l a colonne par gravité ou sous Flash chromatographie. On peut utiliser comme éluant un s olvant unique ou bi en accroître progressivement la polarité de l’éluant de façon à accélérer le déplacement des composés. Les molécules sont entraînées vers le bas à d es vitesses variables selon leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité dans l’éluant. Le chromatogramme se développe en formant une succession de zones cylindriques qui se séparent en migrant vers le bas. A mesure que chaque zone s’écoule de la colonne, on l a recueille.

Facteurs dont dépend la séparation

Quatre facteurs interviennent: • l’adsorbant • l’éluant • la dimension de la colonne • la vitesse d’élution 56

L’adsorbant

Le plus utilisé est l’alumine; cependant, on la limitera aux composés organiques stables car, sous sa forme basique, elle peut provoquer la déshydratation des esters par exemple. Le gel de silice est également fréquemment utilisé pour la séparation de composés qui n’ont pas une stabilité suffisante pour être traités par l’alumine. La granulométrie de l’adsorbant doit être supérieure à cel le des adsorbants utilisés en CCM. Leur taille est habituellement comprise entre 50 et 200 µm. La quantité d’adsorbant dépend de la difficulté de la séparation et de la masse d’échantillon. On peut considérer que pour chaque gramme d’échantillon, il faut 30 à 50 g d’adsorbant si la polarité des composants à séparer est très différente et jusqu’à 200 g si la séparation est difficile

L’éluant

L’éluant est en général un mélange de deux solvants. Au début de l’élution, on commence par le solvant le moins polaire qui entraîne les substances les moins polaires par l’adsorbant. Ensuite on fa it varier la composition de l’éluant en additionnant graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les composés les plus polaires, retenus sur l’adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas de la colonne. 

La dimension de la colonne

Les colonnes spécialement conçues pour cet usage ont à leur base une plaque de verre fritté ou de porcelaine qui permet l’écoulement libre de l’éluant tout en empêchant le passage de l’adsorbant. On peut aussi utiliser une burette, au fond de laquelle on place un tampon de laine de verre et du sable. 57 La quantité d’adsorbant est telle qu’il occupe une hauteur égale à environ 10 fois le diamètre de la colonne. Il faut également prévoir un espace de 10 cm environ au-dessus de l’adsorbant pour placer le solvant. 

La vitesse d’élution

Elle doit être la plus constante possible. Il faut qu’elle soit suffisamment lente pour que le soluté soit au plus près de l’équilibre entre les phases liquide et adsorbée. Elle ne doit pas être trop lente car sinon les substances diffusent dans le solvant et on obt ient des bandes de plus en plus larges et une séparation médiocre.Néanmoins il y’a la chromatographie sur colonne normale et la flash chromatographie qui sont de plus en plus utilisées. Elle permet d’utiliser moins de silice et moins de solvants et les temps d’élution sont plus courts.

Remplissage de la colonne

C’est l’opération la plus délicate car le remplissage doit être le plus homogène possible exempt de bulle d’air. Les surfaces inférieure et supérieure de l’adsorbant doivent être parfaitement horizontales. La colonne étant verticale, le remplissage peut être réalisé selon deux méthodes au choix. 

Remplissage par voie humide

On prépare dans un bécher un mélange homogénéisé de l’adsorbant et du moins polaire des solvants utilisés pour l e développement en ajoutant par petites quantités l’adsorbant dans le solvant afin d’obtenir une bouillie suffisamment fluide qui coulera facilement. A l’aide d’un entonnoir, on verse suffisamment de bouillie pour que l’adsorbant qui se dépose progressivement forme une couche d’environ 2 cm. On tapote les parois de la colonne pour favoriser le tassement de l’adsorbant.

Remplissage par voie sèche

La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l’adsorbant en poudre est ajouté en portions successives dans la colonne à l’aide d’un entonnoir; pendant l’addition, on frappe continuellement sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand la première portion forme une couche d’environ 2 cm, on ouvre le robinet pour faire couler lentement le solvant. On termine comme précédemment.

Dépôt des produits à analyser

Ils doivent former une zone cylindrique étroite dans le haut de la colonne. Un liquide est déposé tel quel. Un solide sera dissous dans le minimum du moins polaire des solvants. On ajuste d’abord le niveau de solvant pour qu’il soit juste au-dessus de celui de l’adsorbant. A l’aide d’une pipette, on coule l’échantillon au sommet de la colonne de façon uniforme sur toute la surface de la colonne sans la déformer. Si nécessaire, on ajuste à nouveau, comme précédemment, le niveau de liquide de la colonne : l’échantillon est ainsi adsorbé uniformément au sommet de la colonne. On peut placer un verre fritté ou une rondelle de papier filtre au-dessus de l’adsorbant pour prévenir une remise en suspension de l’adsorbant.

Elution

On peut alimenter la colonne en continu à l ‘aide d’une ampoule de coulée ou bien ajouter manuellement l’éluant. Dans tous les cas, la surface de l’adsorbant ne doit jamais être au contact de l’air. En quelques minutes, une colonne laissée à sec se détériore: des fissures apparaissent dans la phase fixe et toute élution ultérieure se transforme en ruissellement. Pour la plupart des opérations, une vitesse de 5 à 50 gouttes à la minute convient (la limite inférieure correspond aux séparations difficiles) 59 Lorsque l’analyse des fractions est terminée, on réunit celles qui correspondent à des produits identiques c’est-à-dire ceux qui ont le même Rf, en prenant soin d’éliminer celles qui correspondent à des recouvrements de zones.Les substances obtenues de cette façon sont généralement d’une très grande pureté.

Chromatographie liquide haute performance (C.L.H.P)

Principe

Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne. De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un e nregistreur permet d’obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l’enregistrement d’un pic.Dans des conditions chromatographiques données, le « temps de rétention » (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L’amplitude de ces pics, ou encore l’aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté. 

Appareillage Les organes

Un réservoir de s olvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité suffisante. Plusieurs flacons d’éluants sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d’élution à l’aide de la pompe doseuse. 60 b) La pompe : elle est munie d’un système de gradient permettant d’effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler: – en mode isocratique, c’est-à-dire avec 100% d’un même éluant tout au long de l’analyse. – en mode gradient, c’est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d’éluants. c) Vanne d’injection : c’est un injecteur à boucles d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d’injection permet d’avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l’analyse quantitative. d) La colonne Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm. Au delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop élevées. e) La phase stationnaire – La phase normale: La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l’injection d’une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui sortent en tête. L’inconvénient d’une telle phase, est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations. 61 – La phase inverse : La phase inverse est majoritairement composée de silices greffées par des chaînes linéaires de 8 ou 18 a tomes de c arbone (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H2O). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale, il n’y a pas d’évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante. – La phase mobile : L’interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à polarité inversée se ré percute sur l es temps de rétention des solutés. La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe : – si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie est dite en phase normale ; – si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le plus souvent des mélanges de méthanol ou d’ acétonitrile avec de l’eau), c’est la chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention « k » des composés. Les silices greffées conduisent en général à u ne perte importante de polarité. Avec une phase greffée, l’ordre d’élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases normales. Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu’un composé apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On réalise des gradients d’élution en diminuant au cours de la séparation la polarité de l’éluant (ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration en acétonitrile va en croissant au cours de l’élution).