Étude de l’interaction entre L. pneumophila et
l’autophagie de la cellule hôte

Legionella pneumophila

La légionellose La première épidémie recensée de pneumonie due à Legionella pneumophila a eu lieu lors de la 58ième convention annuelle de la Légion américaine en 1976 à Philadelphie. C’est pour cette raison que la maladie associée a été appelée « maladie du légionnaire ». Depuis, il est courant que cette maladie soit nommée légionellose. Lors de cette première épidémie, 182 individus ont été infectés et 29 sont décédés en dépit d’un traitement antibiotique. L’eau a été considérée comme la source de l’épidémie bien que le mode de contamination n’ait pas été établi (Fraser et al., 1977). C’est en avril 1979 que la taxonomie Legionella pneumophila a été proposée et la souche responsable de cette épidémie a été nommée Legionella pneumophila Philadelphia-1 (Brenner et al., 1979). La caractérisation et l’étude de cette bactérie a mis en évidence qu’il existait, depuis 1943, d’autres cas de maladies humaines associées au genre Legionella (Winn, 1988).

Microbiologie de L. pneumophila

Plus de 60 espèces de Legionella ont été décrites à ce jour (http://www.bacterio.net). Ces gammaprotéobactéries appartiennent à l’ordre des Legionellales qui comprend également les genres Rickettsiella et Coxiella. Ce sont des bactéries à Gram négatif dont la paroi est constituée de deux membranes lipidiques séparées par le périplasme (McDade et al., 1977). Ces espèces sont divisées en sérogroupes basé sur la structure du LPS (lipopolysaccharide) bactérien (Zähringer et al., 1995). Ces bacilles ont une taille comprise entre 0,3 et 0,4µm de largeur et entre 2 et 4µm de longueur (McDade et al., 1977 ; Chandler et al., 1979a) (Figure 1a). Parfois, des formes filamenteuses plus grandes allant jusqu’à 50µm de longueur peuvent être observées, notamment en culture axénique (McDade et al., 1977 ; Chandler et al., 1979b). Cette bactérie aérobie ne forme pas de spores (Chandler et al., 1979a, 1979b ; Brenner, 1986) et possède des pili qui ne semblent pas exprimés lors de l’infection (Rodgers et al., 1980). L’espèce L. pneumophila n’est pas encapsulée et est mobile grâce à un ou plusieurs flagelles en position polaire ou latérale (Thomason et al., 1979 ; Hébert et al., 1984) (Figure 1b). Au contraire, l’espèce L. longbeachae synthétise une capsule et est dépourvue de flagelles, ce qui suggère de fortes variations génétiques entre les espèces du genre Legionella (Cazalet et al., 2010). 28 Figure 1 : Morphologie de Legionella pneumophila (a) Cliché de microscopie électronique à transmission de L. pneumophila après une culture en milieu liquide, à un grossissement de x90 000 (Chandler et al., 1979b). Cette bactérie possède une membrane interne (IM), une membrane externe (OM), des vacuoles (v) et un nucléoïde filamenteux (n). (b) Cliché de microscopie de L. pneumophila après une culture sur milieu gélosé, à un grossissement de x1 500. Certaines bactéries présentent un pilus localisé à un pôle bactérien. Les bactéries du genre Legionella sont ubiquitaires dans les environnements hydrotelluriques tels que l’eau et les sols humides. En particulier, l’espèce L. longbeachae est plutôt retrouvée dans les compostes et les terreaux (Currie et Beattie, 2015) tandis que l’espèce L. pneumophila est principalement présente dans les réservoirs naturels d’eau comme les lacs (Fliermans et al., 1981), les océans (Palmer et al., 1993) et les mers (Heller et al., 1998). La concentration bactérienne dans ces environnements est faible, ce qui limite le risque pour l’homme. Néanmoins, l’omniprésence de cette bactérie rend impossible la prévention de son entrée dans les installations humaines de réseaux d’eau. L. pneumophila est notamment détectable dans les fontaines décoratives, les spas, les piscines, les systèmes de climatisation ou les tours aéroréfrigérantes (Borella et al., 2005). L’eau chaude stagnante dans les canalisations est idéale à la multiplication bactérienne, ce qui conduit à l’accumulation d’une grande quantité de bactéries qui peuvent contaminer l’homme une fois aérosolisées (Borella et al., 2005). Dans ces environnements aquatiques, L. pneumophila est sujette à la dégradation par les amibes, cependant, cette bactérie a évolué afin non seulement d’échapper à cette dégradation mais aussi de se multiplier activement dans ces hôtes. Une vingtaine d’espèces d’amibes et deux espèces de ciliés peuvent notamment être le support de la réplication de cette bactérie (Lau et Ashbolt, 2009 ; Dupuy et al., 2016). Lorsque L. pneumophila est sous sa forme planctonique dans l’eau, elle n’est pas capable de se multiplier (Wadowsky et al., 1988), ainsi, les amibes seraient un moyen pour cette bactérie de se répliquer efficacement tout en étant protégée des stress environnementaux. Les biofilms multi-espèces formés dans les canalisations sont également un moyen de protection pour la bactérie (Abdel-Nour et al., 2013). Chandler et al., 1979b Thomason et al.,1979 (a) (b) 29

Tableau clinique, détection et traitements de la légionellose

La légionellose, contractée suite à l’inhalation de gouttelettes d’eau contaminées, existe sous deux formes cliniques. La fièvre de Pontiac, originellement identifiée en 1968 dans la ville de Pontiac au Michigan (Glick et al., 1978) est une forme bénigne de légionellose. Elle se manifeste, après une période d’incubation d’un à deux jours, par des symptômes pseudo-grippaux qui peuvent durer jusqu’à cinq jours. Cette maladie guérit spontanément en l’absence de traitement et est rarement diagnostiquée sauf lors d’épidémies (Glick et al., 1978 ; Phin et al., 2014). La maladie du légionnaire, forme pulmonaire grave de la légionellose, présente un tableau clinique variable dont les premiers signes sont généralement une intense fatigue physique, de la fièvre et une toux puis la maladie évolue en pneumonie sévère. La principale source de contamination pour la légionellose est l’inhalation de gouttelettes d’eau contaminées. Tandis que la transmission d’homme à homme de cette maladie n’avait jamais été observée, un premier cas a été rapporté en 2015 au Portugal (Borges et al., 2016). Lorsqu’un patient présente les symptômes de la légionellose, le dépistage de la bactérie est possible en recherchant les antigènes solubles, en particulier le LPS, détectable dans les urines un à deux jours après l’apparition des premiers signes cliniques (Campèse et al., 2015). Ce test est particulièrement sensible au sérogroupe-1 de l’espèce L. pneumophila prédominant dans les cas cliniques (Yu et al., 2002). Pour la détection d’un autre sérogroupe, d’une autre espèce et l’identification de la bactérie, la culture, des tests immunologiques et des tests de biologie moléculaire peuvent être utilisés (Ginevra and Freney, 2011). La culture permet la détection et l’identification du genre bactérien basé sur des critères d’auxotrophie et d’aspects macroscopiques. De plus, elle oriente l’identification de l’espèce, en particulier, suite à l’observation de pigments ou d’autofluorescence. D’autres tests phénotypiques basés sur des anticorps spécifiques qui reconnaissent différents épitopes du LPS permettent de déterminer l’appartenance à l’espèce et aux sérogroupes au sein de ces espèces. Les tests de biologie moléculaire peuvent être utilisés sur des prélèvements cliniques ou sur des bactéries isolées suite à leur culture. Ces tests pratiqués en compléments des techniques de phénotypages permettent d’augmenter le pouvoir discriminant de l’identification et de typer les bactéries. Le séquençage de l’ARN16S et du gène mip (macrophage infectivity potentiator) détermine respectivement le genre et l’espèce bactérienne. Plusieurs techniques de typages existent dont le SBT (sequence-based typing) utilisé pour son fort pouvoir discriminant et sa reproductibilité (Lück et al., 2013 ; Khodr et al., 2016). Le SBT est dérivé du MLST (multilocus sequence typing) et est basé sur le séquençage de sept fragments de gènes dont deux gènes de ménages asd (aspartate-βsemialdehyde dehydrogenase) et neuA (N-acetylneuraminate cytidylyl transferase) et cinq gènes associés à la virulence flaA (flagelline du flagelle), pilE (piline du pilus long), mip, momp (major outer membrane protein) et proA (zinc metalloprotease). Un allèle est attribué 30 à chaque séquence, ce qui défini un ST (sequence-type). La grande majorité des cas cliniques mondiaux de légionellose recensés dans la communauté sont dus à l’espèce L. pneumophila, et plus particulièrement à des souches appartenant au sérogroupe-1 (Yu et al., 2002). Il est à noter qu’en Australie et en Nouvelle-Zélande, les espèces L. pneumophila et L. longbeachae ont une prévalence similaire et représentent entre un tiers et la moitié des cas communautaires de légionellose (Graham et al., 2012). Sans qu’aucune explication ne soit connue à ce jour, le sérogroupe-1 de L. pneumophila est prédominant dans les cas cliniques sans l’être dans l’environnement. En France, par exemple, il est responsable de 95,4% des cas cliniques de légionellose mais représente seulement 28,4% des isolats environnementaux (Doleans et al., 2004). La maladie du légionnaire est traitée par des antibiotiques allant d’une monothérapie aux macrolides jusqu’à une combinaison de fluoroquinolones et de macrolides, en fonction de la sévérité de la maladie (Phin et al., 2014 ; Campèse et al., 2015). Le taux de mortalité moyen associé à cette maladie est de 10%, en dépit d’une prise en charge thérapeutique précoce et adaptée et augmente en présence de facteurs de risques tels que le sexe, l’âge, le tabagisme ou l’immunodéficience (Phin et al., 2014 ; Campèse et al., 2015). Actuellement, aucune explication des échecs thérapeutiques n’a été rapportée mais il est possible que des facteurs génétiques humains et/ou la présence de résistances bactériennes aux antibiotiques soient impliqués (Massip et al., en préparation). La légionellose reste donc un problème de santé publique et est une maladie à déclaration obligatoire en France depuis 1987 (InVS pour Institut de Veille Sanitaire). En France, environ 1 300 cas de légionellose sont recensés par an depuis une dizaine d’année malgré la mise en place de différents dispositifs de prévention (Campèse et al., 2015, InVS) (Figure 2). Figure 2 : La légionellose en France L’évolution du nombre de cas et du taux annuel d’incidence de la légionellose est suivie en France depuis 1988. Les statistiques obtenues jusqu’en 2014 sont représentées sur ce graphique.

Variabilité génétique

Les souches Philadelphia-1, Paris et Lens appartenant au sérogroupe-1 ont été les premières dont le génome a été séquencé (Gomez-Valero et Buchrieser, 2013). Le génome de la souche Philadelphia-1, responsable de l’épidémie historique de 1976, a été séquencé en 2004 (Chien et al., 2004). La souche Paris a initialement été considérée comme endémique à la région parisienne sur la base d’une analyse sur 10 ans, de 1988 à 1997, montrant qu’un tiers des cas de légionellose étaient dus à un clone de L. pneumophila du sérogroupe-1 qui fut nommé « Paris » (Lawrence et al., 1999). Cette souche a ensuite été retrouvée dans toute la France, en Europe puis au niveau mondial (Aurell et al., 2003 ; Cazalet et al., 2008a). La souche Lens, quant à elle, a été identifiée lors d’une épidémie s’étendant de novembre 2003 à janvier 2004 dans un périmètre incluant la ville de Lens. L’étude de cette épidémie a mis en évidence que le transport de gouttelettes d’eau contaminées dans l’atmosphère pouvait se faire sur une distance de plus de six kilomètres, ce qui n’avait encore jamais été rapporté (Nguyen et al., 2006). La comparaison des génomes de la souche Paris et de la souche Lens révèle une forte variabilité génétique entre ces souches. En effet, 14% des gènes de la souche Paris ne sont pas retrouvés dans la souche Lens et réciproquement, la souche Lens présente 10% de gènes qui lui sont spécifiques (Cazalet et al., 2004). A titre de comparaison, l’étude des génomes des souches de Salmonella enterica serovar Typhi CT18 et Ty2 montre que la souche CT18 a 1,8% de gènes spécifiques et la souche Ty2 en a uniquement 0,6% (Deng et al., 2003). Le séquençage de cinq génomes supplémentaires du sérogroupe-1 de l’espèce L. pneumophila issus de la souche clinique d’Angleterre Corby, ville aux alentours de Birmingham (Steinert et al., 2007 ; Glöckner et al., 2008), de la souche clinique d’Espagne Alcoy, ville aux alentours de Valence (D’Auria et al., 2010), de la souche clinique des EtatsUnis 130b, isolée dans une ville de l’Ohio (Schroeder et al., 2010), de la souche clinique française Lorraine (Ginevra et al., 2008 ; Gomez-Valero et al., 2011a) et de la souche environnementale française HL 0604 1035 (Gomez-Valero et al., 2011a) a permis une étude génomique comparative. Chacune des huit souches séquencées présente un chromosome circulaire d’une taille comprise entre 3,3 et 3,6 millions de paires de bases, qui code pour environ 3 mille gènes et qui possède un pourcentage en GC (guanine-cytosine) de 38% (Gomez-Valero et Buchrieser, 2013). De plus, chacune de ces souches présente jusqu’à 11% de gènes spécifiques, ce qui confirme la diversité génétique au sein des souches du sérogroupe-1 de l’espèce L. pneumophila (Gomez-Valero et Buchrieser, 2013) (Figure 3). Depuis, des études de comparaison génomique à grande échelle sur des dizaines, voire des centaines de génomes permettent de souligner à quel point les génomes de l’espèce L. pneumophila et du genre Legionella sont plastiques et dynamiques (Burstein et al., 2016 ; Qin et al., 2016). 32 Figure 3 : Répartition des gènes cœurs et spécifiques au sein de différentes souches de L. pneumophila appartenant au sérogroupe-1 Chaque pétale représente un génome avec une couleur associée. Le nombre central représente les gènes cœurs, c’est-à-dire les gènes orthologues partagés entre tous les génomes. Les nombres au sein de chaque pétale correspondent à la quantité et au pourcentage de gènes spécifiques à chaque génome. 

Les éléments génétiques mobiles

La principale source de diversité au sein de l’espèce L. pneumophila provient des éléments génétiques mobiles, probablement acquis par différents transferts horizontaux entre des espèces de Legionella, des souches de L. pneumophila ou même avec un hôte eucaryote. Les transferts horizontaux chez les bactéries peuvent se faire par (i) l’intermédiaire de phages qui incorporent de l’ADN dans le chromosome bactérien, (ii) la conjugaison de plasmides ou de gènes chromosomiques suite à un contact direct entre des bactéries ou (iii) la transformation de l’ADN environnant. Les bactériophages ciblant L. pneumophila sont mal connus, néanmoins la bactérie possède des pili de conjugaison et est naturellement compétente pour la transformation (Lammertyn et al., 2007 ; Grigor’ev et al., 2008 ; Stone et Kwaik, 1998 ; Stone et Kwaik, 1999). De plus, la présence d’ARN (acide ribonucléique) de transfert, de gènes liés à des phages, de transposases ainsi que d’un fort pourcentage en GC sur les éléments génétiques mobiles de L pneumophila suggère l’acquisition de ces derniers par transferts horizontaux. Plusieurs éléments génétiques mobiles ont été identifiés dans les génomes de différentes souches de L. pneumophila et quelques exemples sont présentés dans ce manuscrit. La région lvh (Legionella vir homologues) code pour un SST4 (système de sécrétion de type IV) qui est impliqué dans la conjugaison de plasmides et dans la virulence de L. pneumophila (Segal et al., 1999 ; Bandyopadhyay et al., 2007, 2013). Le réarrangement de l’élément conjugatif et intégratif (ICE, integrative and conjugative element) codant pour le lvh est différent en fonction des souches de L. pneumophila, ce qui suggère des origines et des acquisitions indépendantes de cette région (Cazalet et al., 2008a). Cet ICE peut être intégré d’après Gomez-Valero et Buchrieser, 2013 8,7% 9,1% 8,6% 6,4% 7,4% 11,3% 9,0% Génome cœur 33 au génome ou être libre sous forme circulaire et cette transition semble corrélée à la phase de croissance de la bactérie. En effet, en milieu liquide l’intégration chromosomique de la région lvh prend place au moment de la phase exponentielle et post-exponentielle de la croissance bactérienne (Doleans-Jordheim et al., 2006). La souche Philadelphia-1 contient un îlot de pathogénicité (PAI pour pathogeny island) de 65 mille paires de bases dont certains gènes seraient impliqués dans la réponse au stress oxydatif, ainsi qu’un second SST4 (Brassinga et al., 2003). Ce SST4 code, entre autre, pour des protéines homologues aux protéines Tra (transfert) associées au plasmide F (fertilité) d’Escherichia coli, qui seraient responsables de la synthèse et de l’assemblage du pilus F (Brassinga et al., 2003). Cet îlot de pathogénicité est retrouvé dans certaines souches de L. pneumophila et dans l’espèce L. anisa, ce qui suggère que des transferts horizontaux entre différentes espèces de Legionella peuvent avoir lieu (Cazalet et al., 2008a). De même, un plasmide de 132 mille paires de bases de la souche Paris, code notamment pour des facteurs de virulence homologues à ceux présents dans un plasmide de l’espèce L. longbeachae, ce qui montre un transfert horizontal récent entre les deux espèces bactériennes (Cazalet et al., 2004). 

Les polymorphismes nucléotidiques

Entre la souche Paris et la souche Philadelphia-1, il existe 4% de polymorphismes nucléotidiques, ce qui est élevé puisqu’en comparaison ce pourcentage n’est que de 0,4% entre des souches de L. longbeachae (Cazalet et al., 2010). L’analyse du séquençage global (WGS, whole genome sequencing) de 53 isolats de L. pneumophila a mis en évidence que les polymorphismes nucléotidiques sont majoritairement présents dans le génome accessoire des souches qui représente environ la moitié du génome. En effet, les polymorphismes du génome cœur, c’est-à-dire des gènes partagés entre tous les isolats, ne représentent que 2,8% des polymorphismes totaux (Qin et al., 2016). Les évènements de recombinaison sont donc fréquents au sein de l’espèce L. pneumophila (Qin et al., 2016). A titre de comparaison, le séquençage global de 85 isolats de Streptococcus suis a révélé que 31% des polymorphismes sont observés sur le génome cœur qui représente environ un tiers du génome bactérien (Chen et al., 2013). L’utilisation depuis 40 ans de la souche historique L. pneumophila Philadelphia-1 dans les laboratoires a conduit à une dérive génétique de cette souche. Il existe deux grandes lignées dérivées de la souche initiale qui sont la souche JR32 et la souche Lp02. Une étude phylogénétique a retracé l’évolution de ces deux clones et a notamment mis en avant certains polymorphismes nucléotidiques qui influencent la virulence de L. pneumophila. Cette étude révèle qu’il existe neuf polymorphismes nucléotidiques entre l’isolat clinique séquencé de référence Philadelphia-1 et celui qui a été à l’origine de la dérive des souches JR32 et Lp02. Cependant, certains d’entre eux pourraient être dus à une limite 34 des techniques de séquençage, à cause de la présence de zones de répétitions. Ces polymorphismes nucléotidiques sont présents dans les souches JR32 et Lp02 qui possèdent en plus, respectivement, sept et six polymorphismes spécifiques (Rao et al., 2013) (Figure 4).