Etude de Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) en portage

Epidémiologie

Streptococcus pneumoniae est un germe commensal capsulé ou non des voies aériennes supérieures mais capable également de diffusion ORL, méningée ou de dissémination sanguine (Bactériologie clinique 3ème edition, 2000). Le pneumocoque est responsable d’une forte morbidité et mortalité dans le monde, surtout dans les pays en voie de développement mais également aux USA où il demeure la première cause de décès par maladies infectieuses (Musher, 1992). 23 C’est un germe très fragile qui survit difficilement dans le milieu extérieur, sa transmission est aérienne et se fait de façon directe par l’intermédiaire des gouttelettes de Pflüge. Il est essentiellement humain et est rarement retrouvé chez les animaux. Les facteurs de risque associés au portage rhinopharyngé sont l’âge, la saison, l’importance de la fratrie (taille et composition de la famille), la vie en communauté (crèche, maison de retraite, promiscuité…), l’environnement fumeur, la durée de l’allaitement maternel, la consommation d’antibiotiques….. L’âge : le pneumocoque est présent dans le système trachéo-bronchique humain dès le bas âge. Tous les enfants ont été en contact avec un pneumocoque avant l’âge de deux ans, 50% des enfants de moins de deux ans sont porteurs sains (Bactériologie clinique 3ème edition, 2000). Ce portage est élevé pendant les premières années de vie puis décroît avec l’âge (Hill et al., 2007 ; Gratten et al., 1986 ; Syrjänen et al., 2001), sa durée varie de 3 à 4 mois mais peut aller au-delà. Seuls 15% des sérotypes de portage durant les deux premières années de vie sont associés à des infections respiratoires et à des infections invasives. Les sérotypes les plus fréquemment rencontrés sont le 6, 14, 19 et 23. Le sérotype 1 est rarement retrouvé en portage (Gray et al., 1980). La vie en collectivité : c’est un facteur de risque important de portage de pneumocoques en particulier de souches résistantes (Principi et al., 1999 ; Dagan et al., 1996 ; Henderson et al., 1988) du fait de la fréquence élevée de transmission interhumaine (Regev-Yochay et al., 2004 ; Yagupsky et al., 1998). Le taux de colonisation est très élevé à l’école maternelle (40 à 60%) puis diminue, il est de 6% chez les adultes sans enfants et de 20 à 30% chez les adultes avec enfants (Bactériologie clinique 3ème edition, 2000). Une étude menée en France montrait que la fréquentation d’une crèche multipliait le risque de portage de pneumocoque par un facteur de 1,5 (Dunais et al., 2007). La saison : un pic est observé pendant la saison froide. L’environnement fumeur : les taux de portage rhinopharyngé sont plus élevés parmi des enfants vivant dans un environnement fumeur ou en contact fréquent avec des fumeurs. L’influence d’autres facteurs sur le portage de pneumocoques tels que la durée de l’allaitement maternel, la consommation d’antibiotiques, l’infection par le virus HIV est source de controverses (Principi et al., 1999 ; Ghaffar et al., 1996 ; Kaleida et al., 1993 ; Sung et al., 1995 ; Rusen et al., 1997). Il existe une variation géographique des taux de prévalence du portage de pneumocoque chez les enfants dans le monde. Selon de nombreux auteurs, ces variations dépendent des contextes 24 environnementaux et socioéconomiques, les taux les plus élevés étant retrouvés dans les pays les moins développés (Appelbaum et al., 1996 ; Yomo et al., 1997). Les pneumocoques qui séjournent dans le nasopharynx subissent des contacts avec les antibiotiques au décours de chaque infection traitée par antibiothérapie. Ils constituent donc un réservoir important de souches résistantes aux antibiotiques. Le risque de portage de souches résistantes est accru chez les enfants de moins de 24 mois, principalement ceux chez qui, un traitement antibiotique a été mis en évidence (Fairchok et al., 1996). L’étude du portage est donc intéressante, en ce sens qu’elle permet d’avoir une estimation de la sensibilité du germe aux différents antibiotiques mais aussi parce qu’elle donne un aperçu des sérotypes qui pourraient être incriminés dans les futures infections invasives (De Lencastre et al., 2002 ; Feikin et al., 2000 ; Huebner et al., 1998 ; Rowe et al., 2000). Les plus forts taux de résistance aux antibiotiques des pneumocoques isolés de portage rhinopharyngé ont été rapportés en Asie (Bogaert et al., 2002). Plus de 90% des souches de portage en Chine sont résistantes à l’érythromycine, à la clindamycine, à la tétracycline et 82,5% sont résistantes au TMP-SMX (Liu et al., 2008). Certains auteurs publient des résistances à la pénicilline de 64,3% chez des enfants de moins de cinq ans en Chine en 2006 (Liu et al., 2008). Aux USA, dans une étude menée chez des enfants en bas âge n’ayant jamais reçu de traitement antibiotique, la résistance à la pénicilline était faible (1,2%), mais la résistance au TMP-SMX était de 20% (Faden et al., 1994). En Italie, parmi des enfants sains, 18,8% des souches étaient de sensibilité diminuée à la pénicilline et 52,2% étaient résistantes à l’érythromycine. Dans la même étude, une corrélation positive était trouvée entre la consommation de Macrolides et le portage de souches multirésistantes (Petrosillo et al., 2002). La résistance aux antibiotiques des souches de portage est en augmentation en Côte d’Ivoire : pour la pénicilline elle était de 8,5% en 97 et de 23,5% en 2001 ; pour la cotrimoxazole elle est passée de 52,2% en 97 à 84,3% en 2002; la multirésistance est passée de 9,4% à 23,5% ; la résistance à l’érythromycine par contre a diminué et atteint 8% en 2001 (Kacou-N’douba et al., 2004). Les sérotypes de portage sont en général les mêmes que ceux retrouvés dans les formes invasives, sauf certains d’entre eux tels que le 1 et le 5 qui sont rarement isolés en portage (Brueggemann et al., 2003 ; Sandgren et al., 2004). Les sérotypes de portage sont susceptibles d’entraîner ultérieurement une infection invasive à pneumocoque (Gray et al., 1980) d’où l’intérêt qui leur est porté. 25 Les sérotypes 23F, 6, 14, 19 sont les plus fréquemment retrouvés en portage. En Mozambique, le 19F est largement retrouvé en portage chez les enfants de moins de 5 ans, par contre le 1 et le 5 y sont rarement isolés (Brueggemann et al., 2003, Sandgren et al., 2004). Comme on aura à le voir dans les formes invasives, de nombreuses études menées dans des pays où la vaccination antipneumococcique a été mise en place, ont fait état d’une augmentation de la résistance aux antibiotiques parmi les sérotypes « non vaccinaux ». Ce phénomène a également été observé en portage rhinopharyngé. Aux USA, où le Prevenar® a été mis en place en 2001, dans une étude de portage chez des enfants de moins de 7 ans en 2001-2004, cette résistance concernait le 19A, le 15A et le 35B. Elle est due en majorité à une dissémination importante des différents clones du 19A. Il y a eu également une augmentation de 8 à 25% des PSDP parmi ces souches de sérotypes non vaccinaux durant cette période d’étude (Hanage et al., 2007). Au Vietnam, une étude a montré que l’augmentation de la résistance aux antibiotiques constatée parmi les souches de portage chez des enfants sains est liée à l’émergence et à la dissémination de certains clones du sérogroupe 15 (Schultsz et al., 2007). Le passage de l’état de portage à l’état d’infection invasive par dissémination sanguine n’est pas encore clairement démontré. Cependant certains facteurs tels que le type de souches (virulentes ou non) ou l’état immunitaire de l’hôte favoriseraient ces infections invasives. Les facteurs de risque associés aux infections invasives à pneumocoques sont l’âge, la saison, le sexe, le terrain immunologique. -L’âge : les infections invasives à pneumocoques surviennent plus fréquemment aux âges extrêmes de la vie. Les personnes âgées et les jeunes enfants sont les plus touchés, les périodes à risque se situent entre 0-2 ans et après 65 ans (Myers and Gervaix, 2007). -La saison : les variations saisonnières influent sur la fréquence des infections invasives à pneumocoque. Un pic important est observé en saison froide sous toutes les latitudes à quelques exceptions près telles que l’Alaska où l’incidence est plus élevée pendant l’été. Cette variation saisonnière est plus importante dans les infections invasives des adultes que dans celles des enfants, le pic d’incidence des enfants précédant celui des adultes (Dowell et al., 2003). 

 Inclusion des patients – Critères d’inclusion

Pour les formes invasives, la population étudiée est constituée d’enfants de moins de 5 ans hospitalisés dans des services de pédiatrie des hôpitaux de Dakar pour une infection invasive à pneumocoque. Ces infections pouvant être des méningites, des septicémies ou des pneumopathies avec hémoculture positive (annexe 1). Les tuteurs légaux de l’enfant doivent signer un consentement éclairé avant toute inclusion dans l’étude (annexe 2). Pour les souches de portage rhinopharyngé, il s’agit d’enfants sains de moins de 5 ans consultant dans le cadre de la PMI dans les dispensaires de Medina et de Saint-Martin. Une fiche de renseignement est remplie (annexe 3) ainsi qu’une fiche de consentement dûment signée par les tuteurs de l’enfant (annexe 4). Les paramètres étudiés étaient entre autres l’existence d’une antibiothérapie préalable, l’environnement familial fumeur ou non fumeur, la fréquentation de lieux publics (crèche). – Critères d’exclusion Pour les formes invasives ont été exclus tous les enfants n’ayant pas une preuve biologique d’infection pneumococcique. Pour le portage, la présence de signes cliniques de maladies constituait un critère d’exclusion. II.1.3. Analyse des données Les données ont été saisies au laboratoire de bactériologie de l’Institut Pasteur de Dakar dans une base Access. 33 L’analyse des données a été effectuée au moyen du logiciel STATA. II.2. Etude bactériologique des souches de pneumocoques II.2.1 Prélèvement et culture Le prélèvement rhinopharyngé a été effectué dans des conditions d’asepsie totale à l’aide d’un écouvillon spécial en alginate de calcium muni d’une tige flexible en aluminium mis en contact avec le nasopharynx (annexe 5). Après prélèvement, l’échantillon était conservé dans un milieu de transport, un bouillon cœur cervelle (BCC) puis mis en culture sur gélose au sang à l’Institut Pasteur. Pour les formes invasives les prélèvements ont été effectués en milieu hospitalier. Il s’agit de liquides de ponction (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural, liquide d’ascite, liquide articulaire), d’hémocultures et de sécrétions respiratoires. Ils étaient ensuite acheminés vers les laboratoires hospitaliers où se faisaient les examens directs et la mise en culture (gélose et bouillon). En cas d’isolement de pneumocoque, la souche était acheminée au laboratoire d’analyse médicale de l’Institut Pasteur de Dakar, puis ensemencée sur gélose au sang frais de mouton. Les prélèvements rhinopharyngés étaient ensemencés sur un milieu sélectif (gélose Colombia à 5% de sang de cheval et 15 mg/l d’acide nalidixique). Un disque d’optochine (éthylhydrocupréine) à 0,05% était placé en début d’isolement sur la zone la plus dense de la culture bactérienne afin de faciliter le dépistage du pneumocoque L’incubation était faite à 35-37°C, en atmosphère enrichie de 5% de CO2, pendant 20 à 24H. En cas de culture négative, l’incubation était prolongée dans les mêmes conditions, et les cultures contrôlées au bout de 48 heures. 

Identification

Les colonies de pneumocoques étaient identifiées à partir des caractères suivants (annexe 6) : – Aspect des colonies : La culture de Streptococcus pneumoniae sur gélose au sang de mouton révèle après 24h d’incubation un halo verdâtre autour des colonies qui sont alors dites alpha hémolytiques. Ce halo résulte de la transformation de l’hémoglobine en biliverdine par les colonies bactériennes. En culture anaérobie, l’hémolyse est de type β avec lyse de l’hémoglobine contenue dans le milieu de culture. 34 – Sensibilité à l’optochine : Sur un milieu de culture ensemencé avec le prélèvement, on dépose à l’aide d’une pince flambée et refroidie un disque imprégné d’optochine 0,05% dans la partie la plus dense de l’isolement, puis on incube à 37 °C pendant 24h à l’étuve sous CO2. La sensibilité à l’optochine se déduira du diamètre de la zone d’inhibition. Lorsque ce dernier est supérieur à 14mm (Freney) ou supérieur à 26 mm (CASFM) la souche sera dite sensible à l’optochine. Il faut cependant noter que 5% des pneumocoques sont résistants à l’optochine. – Aspect au gram : Les pneumocoques se présentent sous forme de Cocci à gram positif, groupés en diplocoques. L’aspect au gram se détermine par la technique de coloration dite de Gram qui est réalisée de la façon suivante : – Un frottis est réalisé sur une lame, ensuite cette lame sera plongée successivement dans différentes solutions. – Violet de gentiane pendant 30 à 40 secondes – Solution iodo-iodurée (lugol) pendant 30 à 40 secondes – Solution alcoolisée ou dans un mélange alcool-acétone. Cette étape se fera rapidement. – Les bactéries sont ensuite mises au contact de fuchsine ou de safranine. Les bactéries à paroi riche en lipide laissent passer l’alcool dans le cytoplasme bactérien et sont ainsi décolorées puis recolorées par la fuchsine, ce qui donnera une coloration rose, rouge ou orange typique des bactéries à gram-, visible au microscope. Par contre les bactéries ayant une paroi imperméable à l’alcool ne seront pas décolorées ni recolorées par la fuchsine, elles apparaitront violettes au microscope (violet de gentiane) ce qui est typique des bactéries gram + dont font partie les pneumocoques. – Biochimie : Les colonies de pneumocoques sont de type catalase négative. Sur une culture pure de 24h, on dépose quelques gouttes d’eau oxygénée. Au contact des colonies de pneumocoque, l’absence d’apparition de bulles confirme le caractère catalase négative.