EVALUATION DE LA RESISTANCE AUX
ANTIBIOTIQUES DES ENTEROBACTERIES ISOLEES

Méthodes

La méthode de collecte a consisté à récolter différents échantillons de fèces fraiches de gibiers dans les zones Mbani et Boutsiana du PNMD premièrement ; et deuxièmement, des intestins de gibiers dans certains marchés de Libreville

Méthode sur le terrain

Période de la collecte des échantillons L’échantillonnage a duré 15 jours dans la zone Boutsiana et 5 jours dans la zone Mbani au cours du mois de Juillet 2015. Dans les différents marchés de Libreville, la collecte d’intestins de gibier s’est effectuée pendant 9 jours, cela du 22 au 30 octobre 2015.

Collecte des échantillons 

Dans la forêt du PNMD Pour la collecte des échantillons dans la forêt du PNMD, nous étions accompagnés par deux pisteurs (anciens chasseurs) pour l’aide à l’identification et à la collecte des fèces fraiches de gibier. En effet, ces pisteurs ont des connaissances empiriques sur les crottes d’animaux à partir de leur odeur, couleur et morphologie. Mais la plupart du temps, nous avons fait des observations directes des animaux, ensuite lorsqu’ils se sont déplacés, nous sommes allés ramasser leurs crottes. Des fèces fraiches de diverses espèces de gibier ont été ramassées et mises dans des sacs en plastiques stériles numérotés, tout en marquant le point GPS et l’espèce correspondant à l’échantillon prélevé dans un carnet (figure 7). 48 Figure 7 : Collecte des crottes de gibier dans la forêt du PNMD Au total, 29 échantillons ont été collectés au PNMD, dont 16 échantillons dans la zone Mbani et 13 échantillons dans la zone Boutsiana. Après avoir récolté une dizaine d’échantillons à chaque sortie, l’isolement a eu lieu à la station de recherche de Doussala (figure 8) sous une hotte, par ensemencement des échantillons dans des boites de gélose EMB préalablement préparée et coulée dans des boîtes de Pétri de 60mm (figure 9a) au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET. Figure 8 : Station de recherche en Primatologie de Doussala au PNMD 49 L’incubation a ensuite été réalisée dans une boîte isotherme en polystyrène chauffée (figure 9b) à 37°C à l’aide de 2 à 3 chauffe-mains (Hand-warmers) (figure 9c) (MBEHANG et al., 2015) pendant 24 heures. La température de la boite était périodiquement surveillée (toutes les 3 à 4 heures) à l’aide d’un thermomètre (figure 9c). Vingt-quatre heures (24 heures) après, les boites qui portaient des colonies ont été hermétiquement fermées avec de la paraffine et stockées au réfrigérateur de Tchibanga, la ville la plus proche du village Doussala. Figure 9 : Matériel utilisé pour la culture des entérobactéries au PNMD c : Boîte en polystyrène et thermomètre a : Boîte de Pétri de 60mm contenant la gélose EMB b : Hand-warmer (chauffe-mains) 50  Dans les marchés de Libreville Dans les quatre marchés de Libreville sillonnés, les vendeurs de viande de brousse étaient des femmes. Sur les étals, le gibier se présente frais ou fumé, entier ou en morceaux (figure 10). Les viscères, et en particulier les intestins n’étant pas consommés, sont en général jetés à la poubelle ou stockés dans un coin après l’éviscération de la viande. La collecte s’est faite en fonction des viandes trouvées sur les différents étals et de la disponibilité des viscères. Trois (3) à 4 échantillons d’intestins de gibier différent par marché ont été collectés en fonction de l’abondance d’espèces différentes et de manière à obtenir les mêmes espèces par marché. Au total, une douzaine d’échantillons a été récoltée dans les quatre marchés précités. 

Méthode au laboratoire

Les échantillons recueillis au PNMD ayant déjà été isolés à la station de recherche en primatologie de Doussala, les boîtes de Pétri ensemencées et stockées ont été acheminées au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET pour la culture et l’identification (figures 11a et 11b). 

Isolement

Après avoir acheté les échantillons d’intestins de gibiers dans les différents marchés, la culture a eu lieu au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET (figure 11a). Il a consisté à prélever sous une hotte, pour chaque échantillon et à l’aide d’une anse en plastique stérile, un petit bouton de fèces d’une anse intestinale (colon) préalablement disséquée et à ensemencer une boîte de Pétri de 90mm contenant la gélose EMB (figures 11c et 11d). La boite a été ensuite placée dans un incubateur chauffé à 37°C pendant 24 heures. Après 24 heures d’incubation, les colonies sont caractérisées macroscopiquement sous la hotte (taille, forme et couleur). Puis, en fonction de leur morphologie, elles sont dénombrées. Enfin, chaque colonie observée a été repiquée sur la gélose TS et incubée à 37°C pendant 24 heures. Après incubation, l’identification des bactéries isolées s’est poursuivie à partir de leurs caractères biochimiques. 

Identification des colonies isolées

Suite à l’isolement, les colonies obtenues ont été identifiées à partir de leurs caractères biochimiques à l’aide de galeries Api20E. Mais avant d’utiliser Api20E, ces colonies ont subi un ensemble de tests, à savoir : recherche de la mobilité, la coloration de Gram et le test d’oxydase. A l’issue de ces tests, n’ont été retenues que les colonies Gram – et Oxydase – qui sont les deux caractères communs aux entérobactéries. a: Bâtiment de l’IRET b: Arrivée des échantillons ensemencés en forêt au Laboratoire de Bactériologie de l’IRET c: Dissection d’un rat géant pour prélever une anse intestinale d: Prélèvement du contenu d’une anse intestinale de crocodile nain 53  Utilisation des galeries Api20E Pour se faire, le test a débuté par la préparation d’une suspension bactérienne d’opacité équivalente à 0,5 MacFarland pour chaque type bactérien en mélangeant 5ml d’eau distillée stérile avec 3 à 4 colonies isolées pures et identiques. L’inoculation de la galerie a suivi en introduisant la suspension bactérienne dans les tubes à l’aide d’une pipette Pasteur stérile : – pour les tests CIT, VP et GEL, tube et cupule ont été remplis ; – pour les autres tests, uniquement les tubes ont été remplis ; – pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE, une anaérobiose a été créée en remplissant leur cupule de deux gouttes d’huile de paraffine. Pour finir, la boîte d’incubation a été fermée et incubée à 37°C pendant 24 heures. Après incubation, les galeries ont été sorties de l’étuve. Toutes les réactions spontanées ont été notées sur la fiche de résultats et les tests nécessitant l’addition de réactifs ont été révélés : – Test TDA : 1 goutte de réactif TDA a été ajoutée puis la lecture du résultat a été immédiate ; – Test IND : 1 goutte de réactif JAMES a été ajoutée puis la lecture du résultat a été immédiate ; – Test VP : 1 goutte des réactifs VP 1 et VP 2 a été ajoutée; – Test GLU : 1 goutte des réactifs NT 1 et NT 2 a été ajoutée. Pour ces deux derniers tests (VP et GLU), la lecture des résultats a été faite après une dizaine de minutes. Pour le test GLU, en cas de résultat négatif (coloration jaune), il a été ajouté 2 à 3 mg de poudre de zinc puis l’attente a duré 5 minutes pour la lecture du résultat. S’il est resté jaune, cela indique une réaction positive, il est alors Nitrite – et azote +.Si il y a eu changement de coloration (orange-rouge), la réaction est négative, les nitrates encore présents dans le tube ont été réduits en nitrites par le Zinc ; il est alors Nitrite + et azote -. 54 Enfin, les résultats ont été inscrits sur la fiche de lecture. Les informations contenues dans chacune de ces fiches de lecture ont été ensuite soigneusement rentrées dans le logiciel Api web pour avoir une identification finale des colonies obtenues. Au final, uniquement les souches dont l’Indice d’identification (ID) a été supérieur ou égale à 95% ont été retenues. Ce sont ces souches bactériennes qui ont fait l’objet des tests de résistance aux 8 antibiotiques précités. Mais en attendant la réalisation de cette susceptibilité aux antibiotiques, les souches identifiées ont été stockées dans du TS liquide à 10 % de glycérol au congélateur.

Test de la sensibilité aux antibiotiques

méthode de diffusion en milieu gélosé de disques d’antibiotiques L’utilisation des disques d’antibiotiques ou antibiogramme standard consiste à évaluer in vitro de manière semi-quantitative la sensibilité aux agents antimicrobiens des bactéries à croissance rapide par une méthode de diffusion en milieu gélosé. Le milieu gélosé adéquat pour cette méthode est celui de Mueller Hinton (MH). La méthode utilisée est celle décrite par le Comité de l’Antibiogramme de la société Française de Microbiologie (CA-SFM). Les huit (8) antibiotiques utilisés ont été sélectionnés en utilisant les recommandations du CA-SFM (2015) mais aussi parce qu’ils sont très utilisés en médecine humaine et/ou animale et selon la disponibilité chez le fournisseur (tableau IV).