Evaluation des activités antimicrobiennes

Les études ont été effectuées sur les bactéries et les champignons, et consistent à:  Déterminer le spectre d’activité des produits par criblage sur plusieurs souches afin d’identifier les espèces sensibles ;  Mesurer ces activités par la méthode de l’antibiogramme, les techniquesde dilution en milieu solide et microdilution en milieu liquide pour la détermination de Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) etdeConcentration Minimale Bactéricide (CMB).

Screening antibactérien par la méthode de dilution en milieu solide

La méthode de dilution sur gélose en milieu solide est réalisée sur boîtes de Pétri en utilisant l’inoculateur de Steers. Elle permet de détecter le spectre antibactérien du produit testé à l’issue de l’inhibition ou non de la croissance des souches. Les échantillons sont testés à une dose de 100 mg / L sur des souches de référence. Ils sont mis en solution dans du DMSO pour faciliter leur diffusion dans l’agar. Le témoin négatif contient le DMSO et le témoin positif est constitué de l’Ofloxacine. L’incubation dure 24 h à 37 °C. Pour ce screening, 47 espèces bactériennes (30 Gram négatif et 17 Gram positif) provenant de souches de référence ont été utilisées.

Méthode de l’antibiogramme

La méthode utilisée est celle développée par [8-10]afin de mesurer l’inhibition des bactéries par les extraits de la plante sur boites de Pétri. Après ensemencement d’une quantité de 2 mL de suspensions de bactéries, correspondant à 0,5 Mac Farland, à la surface d’un milieu gélosé Mueller Hinton dans une boîte de Pétri, des disques stériles, d’environ 6mm de diamètre, type BioMérieux, imprégnés de 10 μL d’extrait brut de concentration de la solution mère égale à 100 mg/mL soit 1mg/disque, y sont placés. Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 37°C pendant 24h. Après incubation, les zones d’inhibition de la croissance des bactéries par l’extrait, caractérisées par le diamètre d’halo d’inhibition autour de chaque disque, sont mesurées en mm [11].

Méthode de dilution en milieu solide pour le test d’activité anti moisissure

L’antibiotique est incorporé dans un milieu de culture coulé en boîtes de Pétri. La surface du milieu est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier. Après incubation, la sensibilité des germes est évaluée par un pourcentage d’inhibition. La technique utilisée pour l’étude de l’activité antimoisissure est celle décrite par [12]. Un millilitre de chaque extrait de plante de concentration finale égale à 1mg / mL est inoculé dans 19 mLde milieu de culture PDA (Potato Dextrose Agar) maintenu à 45 °C. Le mélange est ensuite versé dans des boîtes de Pétri. Ces dernières sont mises à sécher pendant 15 minutes à 37 °C. 10 µL de chaque germe testé à une suspension correspondante à 0,5 Mc Farland sont déposés à la surface du milieu. Les boites de Pétri sont incubées à 25 °C pendant 72 heures. Sont considérées positives les cultures où il y a une croissance normale visible des moisissures. Les témoins négatifs ont été préparés par spot des souches testées à la surface des milieux sans extraits .

Evaluation de l’activité antioxydante

Les antioxydants peuvent réduire les radicaux primaires par 2 mécanismes : par transfert d’électron singulet ou par transfert d’atome d’hydrogène. La méthode DPPH joue sur le transfert d’électron singulet alors que la méthode ORAC joue sur le transfert d’un atome d’hydrogène. 

Méthode Bioautography

Les échantillons à tester sont déposés sur des plaques CCM silicagel en verre. Les plaques sont développées dans un système d’élution approprié. Elles sont ensuite révélées par une solution méthanolique de DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) à 25 %. Ce réactif est un radical stable qui, réduit par des capteurs de radicaux, passe du pourpre au jaune, révélant ainsi les composés avec une activité antioxydante. 

Méthode DPPH

Le radical libre DPPH+ est connu pour sa couleur violet-foncé et sa forte absorbance à 517 nm une fois dissout dans le méthanol. Un antioxydant aura la capacité de donner un électron singulet au radical DPPH+ de couleur violette pour le stabiliser en DPPH de coloration jaune-verte. Ainsi, le pouvoir antioxydant des extraits de plantes est mis en évidence en suivant la disparition de la couleur violette, au cours du temps, d’une solution méthanolique contenant le radical libre DPPH+. La mesure de la décroissance de coloration se fait par la mesure de l’absorbance de la solution par spectrophotométrie. La méthode est standardisée en ajoutant un antioxydant de référence (le Trolox : 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid) et en ramenant les résultats à un équivalent Trolox. L’expérience est réalisée sur une microplaque de 96 puits dans laquelle sont mesurées en parallèle, l’absorbance du DPPH en présence d’une concentration donnée du produit à tester et des concentrations croissantes de Trolox de l’ordre de 150 à 600 µmol/L. 

Méthode ORAC

La méthode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) est un test qui combine à la fois le pourcentage d’inhibition de la réaction d’oxydation et la longueur dans le temps de cette inhibition en une seule mesure. Elle donne une mesure globale de la capacité antioxydante [14]. Le générateur de radicaux libres est le plus souvent de l’AAPH (2,2’- Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride), qui produit un radical libre péroxyle en se décomposant sous l’effet de la chaleur (37°C), radical trouvé dans le corps. L’antioxydant de référence, utilisé comme standard dans le test ORAC est le Trolox, un analogue de la vitamine E et un antioxydant bien connu. Les essais sont réalisés dans des microplaques dans lesquelles sont mesurés en parallèle, le déclin de la fluorescéine au cours du temps en présence de concentrations croissantes de Trolox et des échantillons à tester à une concentration donnée. Pour quantifier la protection permise par un antioxydant, l’aire sous la courbe de l’échantillon testé est mesurée et ensuite comparée à l’aire sous la courbe du Trolox .