Évaluation du statut en zinc et de ses déterminants
socioéconomiques chez les enfants

MESURES

Durée de la collecte et ses différentes phases

Sur le terrain, l’équipe était divisée en deux groupes : un groupe d’enquêteurs et un groupe de biologistes. L’enquête et les prélèvements se sont déroulés du 27 mars au 30 mai 2010. La saisie et le contrôle des données ont été effectués du 26 juillet au 11 décembre 2010. 

Prélèvement et dosages biologiques 

Prélèvement et conservation des échantillons

Les échantillons de sang sont obtenus par ponction veineuse à l’aide d’un dispositif constitué d’un tube de prélèvement sous vide en polyéthylène à usage unique, indemne de contamination métallique et contenant l’héparine de lithium comme anticoagulant (Sarstedt AG et Co, Numbredt, Germany). Un échantillon de 5 mL a ét é prélevé à l’abri de la poussière. Auparavant, l’âge, le sexe, l’heure du dernier repas, les heures du prélèvement, de la centrifugation et de l’aliquotage ainsi que la présence de symptômes d’infection sont notés. Les échantillons sont ensuite transportés dans une glacière à 4°C jusqu’à la « voiture laboratoire » où ils ont été traités. Le sang est centrifugé à 767 g (3200 trs/mn) à l’aide d’une centrifugeuse (EBA 20, model 2002 ; Andreas Hettich Gmbh AG Co. KG, Tuttlinger, Germany) pendant 12 min pour obtenir du plasma. Le plasma recueilli est immédiatement réparti dans des cryotubes stériles de 2 ml (Cryovials Nalgène, Nunc International, Rochester, NY 14625- 2385, USA), stockés à – 20°C dans un mini congélateur WAECO (Waeco international GmbH, Emsdetten, Germany) installé dans la « voiture laboratoire », puis conservés au laboratoire à – 80°C jusqu’aux dosages. 

Dosages biologiques 

Dosage du zinc plasmatique 

Appareillage Le zinc plasmatique est mesuré avec un spectrophotomètre de flamme/four graphite (AA800 Model, Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, USA), piloté par le logiciel WinLab 3.2 (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, USA) qui permet de programmer les différentes méthodes de dosage et de traiter les résultats. 8  Principe Le principe de la spectrophotométrie d’absorption atomique de flamme est fondé sur la capacité des électrons des atomes à ab sorber des radiations monochromatiques spécifiques émises à partir d’une source (cathode) en phase vapeur. Cette cathode émet de l’énergie sous la forme de photons de fréquence spécifique de l’élément à doser qui en absorbe une partie. Le courant de la lampe à cathode creuse a été fixé à 15 mA et la raie spectrale a été fixée à 213,9 nm. La flamme air-acétylène a ét é choisie comme source d’atomisation. Ces paramètres instrumentaux ont été optimisés en utilisant une solution de zinc à 1 m g/L, concentration caractéristique de cet élément (Abs=0,2) dans la matrice préconisée par Perkin-Elmer. La mesure de cette absorption (rapport des intensités incidentes et transmises), est proportionnelle à la quantité d’atomes de l’élément à doser et permet donc de déterminer la concentration de l’élément dans la solution par rapport à u ne gamme de calibration préparée à partir d’une solution mère de zinc de 1g/L. L’expression de l’absorbance (A) ou densité optique (DO) est donnée par la loi de Beer-Lambert. Ensuite, le logiciel WinLab 3.2 calcule sur cette base les concentrations respectives des solutions de plasma en tenant compte du facteur de dilution.  Mode opératoire – Préparation des solutions de travail 1. Solution de dilution La solution de dilution est de l’acide chlorhydrique (HCl) 0,1 M (Scharlau Sentmenat, SPAIN). 2. Solutions filles • Une solution fille n°1 de zinc à 150 µmol/L est préparée en complétant 50 µ L de la solution mère de zinc (Reagecon, Clare, Ireland) à 1 g/L à 5000 µL de HCl 0,1 M. • Une solution fille n°2 de zinc à 50 µmol/L est préparée par dilution de 3 mL de la solution fille n°1 avec 6 mL de HCl 0,1 M. 9 – Préparation des calibrants Les calibrants à 5, 10, 20 et 30 µmol/L sont obtenus par dilution de la solution fille n°2 dans du HCl 0,1 M tel qu’indiqué dans le tableau suivant : Concentration (µmol/L) 0 5 10 20 40 Solution fille n°2 (mL) 0 0,5 1 2 4 HCl 0,1 M (mL) 0 4,5 4 3 1 Pour préparer les standards, les calibrants sont dilués au 1/10 (2 ml de calibrant + 18 ml de HCl 0,1 M) et les concentrations des solutions à nébuliser seront donc de 0, 0,5, 1, 2 et 4 µmol/L. Blanc Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Concentration (µmol/L) 0 0,5 1 2 4 Concentration (mg/L) 0 0,033 0,065 0,13 0,26 – Préparation des échantillons et des sérums de contrôle Les échantillons de plasma des sujets et les sérums de contrôle sont dilués au 1/10 dans l’HCl 0,1 M comme suit : Plasma du sujet ou sérums de contrôle 250 µL HCl 0,1 M 2250 µL  Contrôle de qualité L’exactitude et la précision des mesures sont contrôlées à l’aide d’un sérum de contrôle humain (niveau 2) de Randox (Antrim, United Kingdom) et d’un sérum de contrôle interne. Ce contrôle interne préparé au Laboratoire de Nutrition à partir d’un pool de sérum est conservé en plusieurs aliquotes et utilisé dans toutes les séries de dosages. De même, les mesures sont faites en double et toute détermination associée à u n coefficient de variation supérieur à 5% est reprise. 10  Définition de la carence en zinc La définition de la carence en zinc est faite selon les seuils définis par l’International Zinc Nutrition Consultative Group (iZINCG) (Hotz & Brown, 2004). Ces seuils correspondent à une zincémie inferieure à : – 65 µg/dL lorsque le prélèvement est effectué le matin (PM) 57 µg/dL pour un prélèvement fait dans l’après-midi (PAM) 

Dosage de la Protéine C-Réactive

La Protéine C-Réactive (CRP), protéine de la phase aiguë de l’inflammation, a été dosée par immuno-turbidimétrie à l’aide de l’analyseur automatique A15 (Biosystems S.A, Barcelona, Spain). La Protéine C-Réactive (CRP) plasmatique contenue dans l’échantillon provoque une agglutination des particules de latex couvertes avec les anticorps anti-protéine Créactive humaine. L’agglutination des particules de latex est proportionnelle à la concentration en CRP. Le coffret du dosage (Réf 13921, Biosystems S.A, Barcelona, Spain) comprend : • Réactif A (2x16ml) tampon de glycine 0,1 mol/L, azide de sodium 0,95 g/L, ph 8,6. • Réactif B (2x4ml) suspension de particules de latex sensibilisées avec les anticorps anti CRP humaine, azide de sodium 0,95 g/L • Standard (1×1 ml) reconstitué avec de l’eau distillée • Contrôle Rhumatoïde niveau I (3×1 ml, Réf. 31213) • Contrôle Rhumatoïde niveau II (3×1 ml, Réf. 31214)  Mode opératoire Les mesures sont effectuées automatiquement par l’analyseur grâce à la programmation préenregistrée par le fabricant. Cent microlitres (100 µl) de plasma ou de contrôle ou du pool de plasma interne sont introduits dans des cuvettes appropriées. Les réactifs A et B sont mélangés et disposés sur le plateau de réactifs. Au cours de la réaction, 3 µl d’échantillon sont prélevés puis mélangés à 440 µl de réactif CRP. 11  Contrôle de qualité La validité des mesures est vérifiée grâce à des solutions de sérum contrôle Rhumatoïde niveaux I (Réf 31213) et II (Réf 31214) du coffret (BioSystems S.A, Barcelona, Spain). Si la valeur du contrôle est différente de celles indiquées par le fabricant, les résultats ne sont pas validés et les dosages sont repris. De même, la qualité de la mesure est estimée à l’aide du pool de plasma interne dont la valeur doit être comprise dans l’intervalle de la moyenne ± 2SD. L’infection ou l’inflammation aiguë est définie par une valeur de CRP ≥ 5 mg/L.

Dosage de l’alpha-1 Acide Glycoprotéine

La détermination de l’alpha-1 Acide Glycoprotéine (AGP), marqueur chronique de l’inflammation, est faite en même temps que celle de la CRP en immuno-turbidimétrie sur le même automate A15 (Biosystems S.A, Barcelona, Spain). La dispersion des particules de la lumière générée par les complexes antigène-anticorps est proportionnelle à la concentration en AGP de l’échantillon. Les réactifs (Biosystems S.A, Barcelona, Spain) sont constitués de : – Réactif AGP (1×50 ml Ref 31928) – Contrôle niveau I (Réf. 31211) – Contrôle niveau II (Réf. 31212)  Mode opératoire Un volume de 100 µl de plasma introduit dans une cupule est aspiré par l’analyseur qui effectue automatiquement les dilutions et le mélange avec les anticorps. L’AGP, présent dans l’échantillon, précipite en présence d’anticorps anti-alpha 1-glycoprotéine acide humaine. La dispersion de la lumière générée par les complexes antigènes-anticorps est proportionnelle à la concentration en acide α-1 glycoprotéine et peut être quantifiée par turbidimétrie.  Contrôle de qualité La précision et la validité des mesures ont été contrôlées avec deux solutions contrôle de niveaux I (Réf. 31211) et II (Réf. 31212) du coffret (BioSystems S.A, Barcelona, Spain). Une valeur seuil de d’AGP ≥ 1 g/L indique une infection chronique. 

SAISIE ET ANALYSE STATISTIQUE DES DONNEES Le logiciel Epi Info

(Center for Disease Control and Prevention Atlanta, USA) et Excel (Microsoft Corporation, Redmond, USA) est utilisé pour la saisie et le contrôle des données et le logiciel STATA/SE11.1 (Stata Corporation, Texas, USA) pour l’analyse des données. Une description statistique a p ermis d’examiner la distribution des variables, les résultats sont exprimés en moyennes ± écart-types, en pourcentage, en maximum-minimum et 25ème-75èmepercentiles. La variable CRP dont la distribution n’est pas gaussienne a subi une transformation logarithmique avant d’être exprimée en moyenne géométrique ± écart type. Pour avoir une représentativité nationale les statistiques descriptives sont pondérés ainsi que les comparaisons de moyennes. Le test ANOVA est utilisé pour comparer la moyenne du zinc plasmatique en fonction de la tranche d’âge et le test de χ² de Pearson pour comparer les pourcentages en fonction des tranches d’âge. Nous avons également effectué des modèles distincts de régression linéaire pour évaluer l’effet des facteurs de confusion sur la concentration plasmatique de zinc. Une analyse de covariance (General Linear Model) est faite pour comparer les moyennes de zinc plasmatique en fonction de la tranche d’âge en corrigeant l’effet des facteurs confondants. La corrélation de Pearson a p ermis d’évaluer la relation entre le statut en zinc et le statut infectieux. Les données socioéconomiques ont été analysées pour générer un modèle de quintile de pauvreté comprenant 5 modalités (pauvre, relativement pauvre, niveau de vie moyen, relativement non pa uvre et non pa uvre). Des tests de régression linéaire simple et multiples sont effectués entre le zinc plasmatique (variable dépendante) et les facteurs biologiques tels que la concentration plasmatique de rétinol, le taux d’hémoglobine, la ferritine plasmatique, l’AGP et la CRP, les facteurs socio-économiques (variables explicatives). Et enfin, un modèle logistique multiple est effectué pour évaluer les facteurs de risque de carence en zinc en tenant compte de tous les facteurs significatifs de la régression multiple. Un seuil de significativité de 5% est retenu pour toutes les analyses statistiques.