La biologie moléculaire principe de la PCR (polyméraseChain R ea cti on)

Depuis plusieurs années, le développement des techniques de biologie moléculaire dans le domaine microbiologique est en plein essor. En Parasitologie, les problématiques liées au manque de sensibilité et de spécificité des outils actuels, incitent à positionner à terme la PCR comme gold standard (59). En effet, l’amélioration du diagnostic et la possibilité d’un suivi de ces maladies semblent nécessaires pour une détermination précise des prévalences et une prise en charge globale dans les régions du monde impactées par ces maladies. Principe La PCR permet d’obtenir rapidement une quantité importante et exploitable d’un segment précis d’ADN ou d’ARN. Il s’agit d’une succession de réactions de réplication permettant d’amplifier plusieurs millions de fois la séquence d’intérêt. La quantification d’ADN obtenu se fait ensuite par migration sur gel d’agarose (74). La PCR repose sur le mécanisme de réplication de l’ADN, celle-ci nécessite l’action d’une ADN polymérase (la Taq polymérase), enzyme permettant la copie d’un brin complémentaire de l’ADN simple brin ciblé grâce à l’inclusion dans le milieu réactionnel d’amorces nucléotidiques se fixant sur deux brins monocaténaires. Un cycle de PCR se déroule en quatre étapes comme représenté dans la figure 14 : La biologie moléculaire principe de la PCR (polyméraseChain R ea cti on) 54 Figure 14 : Schéma d’un cycle de PCR. La première étape est celle de dénaturation, le chauffage provoque la séparation des doubles brins d’ADN aboutissant à l’obtention de simples brins, les amorces sont libres dans le milieu. Lors de l’hybridation, les amorces nucléotidiques se fixent aux extrémités des séquences à amplifier. L’élongation ou polymérisation fait intervenir l’ADN polymérase qui permet l’extension des brins d’ADN. Chaque cycle de PCR est répété une quarantaine de fois et l’amplification est exponentielle, aboutissant à plusieurs millions de copies. La PCR dite classique nécessite une deuxième étape de quantification d’ADN à l’aide d’une migration sur gel d’agarose de produits amplifiés grâce à l’utilisation de produits intercalants de l’ADN

La PCR en temps réel ou qPCR

Le principe technique et les différentes approches

De nouvelles technologies de PCR quantitatives ont vu le jour ces dernières années, il s’agit de PCR en temps-réel (qPCR), elles permettent ainsi par l’utilisation de sondes ou de produits se fixant au petit sillon de l’ADN double brin (STBR Green I), d’émettre un signal fluorescent directement proportionnel à la quantité d’ADN amplifié en temps réel (75,76). Différentes techniques sont disponibles : La technique par hydrolyse de sonde (Taqman), la technique par hybridation de deux sondes Fluorescence resonnance Energy Transfer (FRET) et l’utilisation de balises moléculaires (MolecularBaecons). • Technique TAQMAN : Les sondes utilisées par la technique Taqman sont les plus utilisées. La sonde ‘TaqMan’ est une séquence oligonucléotidique spécifique de la matrice, marquée en 5’ par un fluorochrome (reporteur) dont la fluorescence est inhibée par un désactivateur (quencher) en 3’. Le principe repose sur l’activité exonucléase de la Taq qui va hydrolyser la sonde lors de l’amplification libérant le fluorochrome reporteur. La fluorescence émise est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés lors de la PCR. Figure 15 : Principe des sondes Taqman 56 Lors de l’étape de dénaturation (a), le chauffage provoque la séparation des doubles brins d’ADN avec la présence de sondes et d’amorces libres dans le milieu. Aucune fluorescence n’est observée lors de cette étape, le reporteur étant proche du quencher. Lors de l’hybridation (b) les amorces se fixent aux extrémités des séquences à amplifier et la sonde s’hybride sur la séquence cible correspondante. L’élongation ou polymérisation (c) fait intervenir la Taq polymérase qui, en synthétisant le brin complémentaire, va lyser la sonde entraînant une libération du reporteur et l’émission d’une fluorescence détectée par le thermocycleur. • Technique FRET : La technique FRET utilise deux sondes linéaires complémentaires d’une séquence cible l’une étant marquée en 3’, l’autre en 5’ par un marqueur. La proximité des deux fluorophores sur l’ADN cible permet un transfert d’énergie quantifié par une fluorescence rouge. • Technique MOLECULAR La technique molecular beacons fait appel à une sonde en épingle à cheveux équipée d’un fluorophore émetteur et d’un fluorophore suppresseur (quencher). Lors de l’hybridation une émission de fluorescence est observée par éloignement des deux sondes, puis l’élongation libère la balise et arrête alors toute émission de fluorescence permettant de quantifier la quantité d’ADN amplifiée. Cette technique est très spécifique mais les sondes restent difficiles à designer.