Modifications fonctionnelles en position C2 des 8-alkylthiazolo[5,4-f]quinazolin-9(8H)-ones

DYRK1A

Chez l’homme, la sous-famille DYRK (Dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase), issue de la famille du même nom et du groupe CMGC est constituée de cinq membres : DYRK1A, DYRK1B (aussi appelé Mirk), DYRK2, DYRK3 et DYRK4. Bien qu’elles fassent partie de la catégorie sérine/thréonine kinases, ces enzymes sont définies par leur « double spécificité » ; c’est-àdire qu’elles sont capables d’auto-phosphoryler un de leurs résidus tyrosines, engendrant leur autoactivation. Les DYRK peuvent donc catalyser la phosphorylation de résidus tyrosines, sérines et thréonines.5,6 DYRK1A est présente dans le système nerveux central dès la vie fœtale, suggérant un certain rôle dans le développement, la maturation et le vieillissement neuronal. Cette kinase a une interaction directe ou indirecte avec des centaines de gènes dans le corps humain. Son dysfonctionnement peut entraîner de lourdes répercussions sur la santé et déclencher de graves maladies. La protéine kinase DYRK1A a beaucoup été étudiée pour son implication dans certaines maladies neurodégénératives telles que le syndrome de Down (SD), plus connu sous le nom de trisomie 21, et la maladie d’Alzheimer (MA), mais aussi en cancérologie pour son implication dans le contrôle du cycle cellulaire.

L’implication de DYRK1A dans le système nerveux central

La famille des Dual-Specificity Tyrosine Regulated Kinases (DYRK), et plus particulièrement DYRK1A, est codée par un gène situé sur le chromosome 21. De nombreuses études ont montré qu’un taux anormalement élevé de DYRK1A dans le système nerveux central entraînait la neurodégénérescence fibrillaire, la formation de plaques β-amyloïdes et la mort neuronale en jouant un rôle significatif dans le défaut du développement cérébral, la neurodégénérescence précoce, la perte neuronale, et la démence. La surexpression de DYRK1A est donc un acteur important dans la dérégulation des multiples voies du développement et du vieillissement du cerveau. Cette surexpression a été identifiée chez les patients atteints de la MA mais aussi chez les patients atteints du SD qui comptent 1,5 fois plus de DYRK1A qu’un individu sain, dû à la trisomie du chromosome 21. Presque tous les patients atteints du SD présentent les symptômes de la MA à partir de 5 S. Aranda, A. Laguna, S. de la Luna, FASEB J. 2011, 25, 449–462. 6 A. Walte, K. Rüben, R. Birner‐Gruenberger, C. Preisinger, S. Bamberg‐Lemper, N. Hilz, F. Bracher, W. Becker, FEBS J. 2013, 280, 4495–4511. 7 (a) J. Wegiel, C.-X. Gong, Y.-W. Hwang, FEBS J. 2011, 278, 236–245, (b) S. Stotani, F. Giordanetto, F. Medda, Future Med. Chem. 2016, 8, 681–696. Introduction générale 13 40 ans, à savoir une neurodégénérescence liée à l’hyperphosphorylation de la protéine Tau et à la formation de plaques β-amyloïdes. On parle dans ce cas d’une pathologie « type Alzheimer ».

La phosphorylation de la protéine Tau

Dans les neurones, les microtubules jouent un rôle important dans la composition des axones qui conduisent l’influx nerveux. La stabilité des microtubules assure la transmission du message tandis que leur instabilité conduit à la dégénérescence de l’axone, voire à la mort neuronale.8 Cet équilibre est fortement lié à la phosphorylation de la protéine tau (tubulin-associated unit), qui constitue majoritairement la famille des MAP (microtubules associated proteins). Elle favorise l’assemblage et la stabilisation des microtubules qui forment le cytosquelette des cellules eucaryotes.9 Son hyperphosphorylation entraîne la déstabilisation des microtubules. La surexpression de DYRK1A dans le cerveau peut contribuer à la dégénérescence neurofibrillaire précoce, soit directement avec l’hyperphosphorylation des protéines tau, soit indirectement avec la phosphorylation de facteur d’épissage alternatif, menant au déséquilibre entre tau3R et tau4R. La kinase DYRK1A peut phosphoryler onze sites sur les protéines tau associées aux microtubules. Sa surexpression contribue directement à l’hyperphosphorylation de tau. La phosphorylation par DYRK1A favorise la phosphorylation par GSK-3β, une autre protéine kinase du groupe CMGC. Cette hyperphosphorylation anormale entraîne la perte des fonctions biologiques de tau, causant la baisse de son activité pour stimuler l’assemblage des microtubules. En plus d’une désorganisation du cytosquelette, cela a pour conséquence leur agrégation sous forme de neurofibrilles et leur solubilisation dans le cytosol sous forme d’oligomère intermédiaire (Figure 3). Ces oligomères favoriseraient la désorganisation des microtubules et inhiberaient leur assemblage, engendrant à terme l’apoptose du neurone. La phosphorylation de tau par DYRK1A favorise aussi leur propre agrégation avec des protéines tau normales et d’autres protéines associées aux microtubules.  Figure 3 : Neurodégénérescence fibrillaire engendrant la déstabilisation des microtubules dans les neurones. Il existe plusieurs isoformes de la protéine tau. Deux d’entre elles, nommées tau3R et tau4R doivent être en proportion égale pour assurer des fonctions neuronales de manière optimale. DYRK1A phosphoryle le facteur d’épissage alternatif de tau favorisant l’expression de tau3R. La surexpression de DYRK1A engendre la prédominance de tau3R par rapport à tau4R, ce qui entraîne un déséquilibre de la proportion des deux isoformes, contribuant à l’altération du cytosquelette. 2.a.ii. La phosphorylation des précurseurs amyloïdes La kinase DYRK1A phosphoryle aussi des protéines membranaires, appelées APP (Amyloid Precursor Proteins). La surexpression de DYRK1A facilite le clivage des APP, favorisant la formation de protéines bêta-amyloïdes et de l’oligomère Aβ. Ces oligomères solubles dans le cytoplasme sont toxiques. Ils inhibent l’activité neuronale liée à l’apprentissage et la mémoire, perturbent de façon transitoire des comportements appris, provoquent la démence et favorisent l’expression de la kinase DYRK1A. Les protéines bêta-amyloïdes, quant à elles, s’agglomèrent pour former des plaques, connues sous le nom de plaques séniles. Ces agrégats protéiques peuvent couper la communication synaptique en jouant un rôle dans le cycle de la synthèse de l’acétylcholine, neurotransmetteur impliqué dans la mémorisation et l’apprentissage.Dans tous les cas, la surexpression de la protéine kinase DYRK1A provoque le déséquilibre soit des microtubules, ce qui peut engendrer la dégénérescence neurofibrillaire puis la mort neuronale, soit de la synthèse de l’acétylcholine, entraînant la perte de la communication neuronale (Schéma 4). Schéma 4 : Effet de la surexpression de DYRK1A dans le système nerveux central.

L’implication de DYRK1A dans le cycle cellulaire

De nombreuses études montrent la régulation de diverses fonctions biologiques par la kinase DYRK1A. En effet, cette protéine a entre autres une action sur la transcription cellulaire,13 l’épissage de l’ARN messager,14 les tumeurs des patients atteints de leucémie mégacaryocytaire et du SD,15 l’apoptose,16 ainsi que sur le cycle cellulaire. Dans le cadre de cette thèse et afin de mieux comprendre les différents tests biologiques qui seront réalisés sur les molécules synthétisées, seule l’action de DYRK1A sur le cycle cellulaire sera abordée. Le cycle cellulaire est fortement contrôlé par les protéines kinases. Ainsi, une cellule commence son cycle au stade G1, phase de préparation au stade S au cours de laquelle l’ADN est répliqué. Vient ensuite la phase G2 qui prépare la phase de mitose (phase M) pendant laquelle les chromosomes sont  dédoublés, formant deux cellules filles. Si les cellules filles ne reçoivent pas de signaux pour recommencer un cycle cellulaire, elles quittent le processus et deviennent quiescentes (phase G0). Les cellules n’ont alors plus ou peu d’interactions avec le milieu cellulaire (Figure 4). Elles cessent leur prolifération ; elles n’entameront un cycle cellulaire que sous l’effet de signaux mitogènes. Figure 4 : Phases du cycle cellulaire.17 Afin d’entrer dans le cycle cellulaire, en G1, une cellule suit l’activation d’une cascade de protéines kinases conduisant à la stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l’entrée en division. En général, il s’agit des cyclines D.18 Si ces cyclines ne sont pas présentes, ou inhibées, la cellule entrera et restera en quiescence. Pour les cellules cancéreuses, la quiescence est la première étape de la dormance tumorale qui est la période, après le traitement, où les cellules résiduelles sont indétectables. Des rechutes de cancer sont observées lorsque ces cellules repartent dans le cycle cellulaire.19 La kinase DYRK1A phosphoryle les cyclines D. Cette phosphorylation induit leur destruction, ce qui engendre la sortie du cycle cellulaire. Ce mécanisme a été démontré dans les cellules précurseurs de lymphocytes B et T avec la phosphorylation des cyclines D3,20 mais aussi dans les cellules neuronales avec la phosphorylation des cyclines D1.21 La surexpression de DYRK1A a donc pour conséquence de conduire les cellules vers un stade G0. en phosphorylant un de ses membres. Composés de plusieurs protéines, ces complexes engendrent la quiescence et réduisent de manière significative la prolifération de cellules cancéreuses. La formation de DREAM provoque aussi la répression des gènes cibles E2F qui sont des acteurs de la sortie du cycle cellulaire et de la correcte différenciation des cellules lors de la transition G1-S. La surexpression de DYRK1A impacte fortement la quiescence et empêche la prolifération des cellules (Schéma 5). Schéma 5 : Implication et effets de DYRK1A dans le cycle cellulaire. Il est à noter que DYRK1B joue aussi un rôle dans le cycle cellulaire puisqu’il participe aux mécanismes qui maintiennent l’état de quiescence.23 Ces études montrent que le taux de DYRK1A joue un rôle important dans l’équilibre neuronal et la régulation de la prolifération des cellules. Il est donc pertinent de contrôler ces mécanismes avec un inhibiteur spécifique de cette protéine kinase. 22 S. Sadasivam, J. A. DeCaprio, Nat. Rev. Cancer 2013, 13, 585–595 X. Deng, E. Friedman, Genes Cancer 2014, 5, 337–347. Introduction générale 18 3. Les inhibiteurs de DYRK1A24 Pour atteindre leur cible, les inhibiteurs de kinase doivent généralement franchir les barrières cellulaires, voire la barrière hémato-encéphalique (BHE) pour une action sur le système nerveux central. Des paramètres physico-chimiques comme la stabilité métabolique ou encore la balance lipophilie/hydrophilie sont à prendre en considération afin d’assurer la biodisponibilité des inhibiteurs. La plupart des inhibiteurs de la kinase DYRK1A sont ATP-compétitifs et dits de type 1. Il s’agit de petites molécules qui forment des interactions avec la poche catalytique dans la kinase active. Ces molécules imitent les sites d’ancrage de l’adénine de l’ATP en formant des liaisons hydrogène avec des résidus de la région charnière de la kinase. Elles ont aussi souvent des interactions avec les différentes poches hydrophobes du site catalytique.25 Les inhibiteurs de DYRK1A ont généralement une structure plane, hétéroaromatique, possédant un à deux groupements accepteurs et/ou donneurs de liaisons hydrogène. Ils ont aussi communément un motif aromatique, hydrophobe, capable d’interagir avec la poche hydrophobe arrière du site catalytique, voire avec l’acide aminé portier phénylalanine (Phe 238) (Figure 5). On distingue les inhibiteurs naturels et les inhibiteurs synthétiques.