Réactifs et enzymes

Lipases Novozym

(lipase de Candida antarctica B immobilisée sur des billes de résine acrylique macroporeuse, ≥5000 U/mg). Société Novo. CRL (lipase de Candida rugosa type VII, ≥700 U/mg), ROL (lipase de Rhizopus oryzae, ≥30 U/mg), PCL (lipase de Pseudomonas cepacia, ≥30 U/mg) et PPL (lipase de pancréas du porc type II, 100-500 U/mg) provenant de Sigma. Lipase AK (lipase de Pseudomonas fluorescens, ≥20 U/g), Lipase PS (lipase de Burkholderia cepacia, ≥30 U/g) et Lipase G (lipase de Penicillium camemberti, ≥20 U/g) issues Amano. Lipozyme® IM (lipase de Mucor miehei immobilisée sur une résine macroporeuse échangeuse d’anions, ≥30 U/g) issue de Novo. U/g : 1 unité correspond à la quantité d’enzyme qui permet la libération d’1 µmol d’un acide gras par heure à pH 7,2 à 30 °C lors de l’hydrolyse d’un triglycéride (souvent l’hydrolyse de la trioléine en acide oléique). 2.2. Réactifs et solvants Alcools : (R,S)-1-phenylethanol (purité >99%), (R)-1-phenylethanol, (R,S)-2-Pentanol (>99%), (S)-2-Pentanol, (±)-Menthol, (−)-Menthol; (±)-Sulcatol (>99%) et (−)-Sulcatol issus de Sigma Aldrich. α-cyclogeraniol ((2,6,6-triméthylcyclohex-2-ényl) méthanol) racémique préparé par réduction avec LiAlH4 de α-cyclogeraniate d’éthyle1 . Donneurs d’acyle : Acétate de vinyle (>99%), propionate de vinyle (>99%), Butyrate de vinyle (>99%), Laurate de vinyle (>98%), Acétate d’éthyle (>99%) et Butyrate de butyle (>99%) provenant de Sigma Aldrich. Solvants : Cyclopentyl méthyle éther (>99%) and 2-methyltetrahydrofurane (99%) issus de Alfa Aesar. Chapitre 2. [Matériels et méthodes] 75 THF, éther diéthylique, dichlorométhane, chloroforme, toluène, hexane et tert-butyle méthyle éther provenant de Sigma Aldrich. Liquides ioniques : 1-butyl-3-méthylimidazolium bis(trifluorométhylsulfonyl)imide ([BMIM] [TFSI], ≥ 98%), 1-butyl-3-méthylimidazolium tetrafluoroborate ([BMIM] [BF4], ≥ 98.5%) et 1-méthyl-3-octylimidazolium tetrafluoroborate ([OMIM][BF4], ≥ 98%) issus de Sigma Aldrich. Figure 1. Structures des alcools racémiques utilisés.

Matériels

Ultrasons

Deux systèmes d’ultrasons ont été utilisés dans cette étude : • Bain à ultrasons : Branson 1510E-MTH (Branson Ultrasonics Corporation, ÉtatsUnis), équipé essentiellement d’un conteneur rectangulaire (14,0 cm x 15,0 cm x 10,0 cm). La puissance maximale de cet appareil est de 143 W et la fréquence de 40 kHz. La température de l’eau dans le bain a été contrôlée avec une précision de ± 1 °C. • Sonde à ultrasons : Microson Ultrasonic Cell Disruptor (Misonix XL2000), équipé d’un générateur (33,0 cm x 19,0 cm x 17,0 cm) et une sonde (17,0 cm x 3,0 cm). La puissance maximale générée par cet appareil est de 100 W avec une fréquence de 22,5 kHz. Chapitre 2. [Matériels et méthodes] 76 Figure 2. Système à ultrasons utilisé, Branson 1510E-MTH et Misonix XL2000. 2.2. Chromatographie phase gazeuse (CPG) Deux appareils de Chromatographie phase gazeuse (CPG) ont été utilisés dans cette étude : • GC-17, SHIMADZU : équipé d’un détecteur d’ionisation de flamme d’hydrogène (FID) et d’une colonne capillaire chirale Beta-dexTM 325 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) pour l’analyse GC des alcools racémiques (R,S)-1-phényléthanol, (R,S)-2-pentanol et (±)-menthol. • Agilent Technologies 6850 : équipé d’un détecteur d’ionisation de flamme d’hydrogène (FID) et d’une colonne capillaire chiral DMePentil-BETACDX (25 m x 0,25 mm x 0,15 µm) pour l’analyse GC du (±)-sulcatol et d’une colonne Beta-MEGA-DEX DAC (25m x 0.25mm x 0.25µm) pour l’analyse de (±)-menthol et (±)-α-cyclogeraniol. Figure 3. CPG utilisée, GC-17 SHIMADZU et Agilent Technologies 6850.

Protocoles des réactions réalisées

Réactions sous ultrasons

Prétraitement des lipases par ultrasons Dans un tube hermétiquement fermé, 50 mg de lipase sont solubilisés dans 3,5 ml de solvant (éther diéthylique, hexane, toluène, dichlorométhane, chloroforme ou THF) et traités aux ultrasons pendant une période donnée. Ensuite, une solution d’alcool secondaire (5 mM) et de donneur d’acyle (10 mM) est ajoutée à l’enzyme prétraitée, puis le mélange est mis sous agitation magnétique thermostatée à différentes température. Des prélèvements de 25 µL sont effectués à la fin de la réaction puis analysés par CPG permettant de calculer la conversion (C) et le facteur d’énantiosélectivité E.

Transestérification des alcools secondaires

Dans un tube hermétiquement fermé, 5 mM d’alcool secondaire racémique et 10 mM de donneur d’acyle sont solubilisés dans 4 ml de solvant organique. La réaction est ensuite initiée par addition de 50 mg de lipase et mise sous ultrasons pendant différentes durées (selon l’alcool et le donneur d’acyle, schéma 1). Les expériences par agitation avec les lipases ou avec les lipases pré-irradiées sont effectuées dans un bain d’huile sous agitation magnétique (200 tr/ min). Les expériences sous irradiation ultrasonore sont réalisées en plaçant le mélange réactionnel au centre du bain d’eau ultrasonique ou en mettant la pointe de la sonde d’ultrasons au centre d’un tube contenant le mélange réactionnel.