Rôle des lactobacilles isolés de différents biotopes
dans le contrôle de la microflore vaginale

Caractérisation des souches isolées

Caractérisation des microorganismes vaginaux potentiellement pathogènes

Tests préliminaires a- Coloration de Gram : C’est une coloration différentielle qui divise les bactéries en deux classes : Gram+ et Gram-. Elle est basée sur la composition différentielle de la paroi en lipides qui sont élevés (20%) chez les Gram- et faibles chez les Gram+ (Nauciel et Vilde, 2005). b- Recherche de la catalase: La catalase est une enzyme qui a la propriété de décomposer l’eau oxygénée (H2O2) avec libération d’oxygène et formation d’eau (Denis et al ., 2007). La réaction chimique est la suivante : c- Recherche d’oxydase : Le cytochrome oxydase est le dernier transporteur d’électrons dans la chaîne respiratoire. Il catalyse le transport d’hydrogène sur l’oxygène moléculaire ; ce qui aboutit à la formation de l’eau oxygénée (H2O2). Pour ce test, utiliser des disques (OX), imprégnés d’un substrat incolore qui est l’oxalate de N-diméthyle paraphényldiamine. Ce dernier sous l’action de l’oxydase, forme une semi-quinone de couleur rouge, instable qui s’oxyde rapidement en donnant un composé noirâtre. 2H2O2 → O2 + 2H2O MATERIELS ET METHODES [CHAP 1 : Isolement et caractérisation des microorganismes de différents biotopes] 38 d- Test de nitrate réductase Certaines bactéries ont la capacité de réduire les nitrates en nitrite, puis parfois en diazote (N2) (Delarras, 1998). La synthèse de nitrate réductase est inductible en anaérobiose (Béraud, 2001). NO3-+ 2H+ + 2e- NO2 +H2O Nitrates Nitrate réductase Nitrites 1.5.1.2. Caractérisation biochimique (Système API, BioMérieux) a- Système API 20E : (Bio Mérieux) L’API 20 E est un système miniaturisé pour l’identification des Enterobacteriaceae et autres bactéries Gram négatives. Cette galerie comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratée. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les milieux. La technique d’ensemencement suit le protocole préconisé pour API 20 E dont l’incubation se fait à 37°C pendant 24 h. La lecture se fait à l’aide du tableau des réactions, et l’identification est obtenue à l’aide d’un tableau analytique ou tableau d’identification (Joffin et Leyral, 1998). b- Système API Staph : (bio Mérieux) API Staph est un système d’identification des genres Staphylococcus et Micrococcus comportant des tests biochimiques standardisés et miniaturisés Cette galerie comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratée, leur reconstitution se fait lors de l’addition à chaque tube de l’API d’un milieu API Staph Medium ensemencé avec la souche à étudier. La technique d’ensemencement suit le protocole préconisé pour API Staph. L’incubation se fait à 37°C pendant 24 h. Les réactions produites pendant l’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés après l’utilisation de substrats ou révélés par l’addition de réactifs. La lecture se fait à l’aide du tableau des réactions, et l’identification se fait par l’utilisation du catalogue analytique API Staph (Joffin et Leyral, 1998). c- Système API 20NE : (bio Mérieux) API 20 NE est un système standardisé pour l’identification des bacilles à Gram négatif non enterobactéries et non fastidieux (ex. Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, etc.) combinant 8 tests conventionnels, 12 tests d’assimilation, et une base de données. La galerie API 20 NE comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés. Les tests conventionnels sont inoculés avec une suspension bactérienne saline qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs. Les tests d’assimilation sont inoculés avec un milieu minimum et les bactéries cultivent seulement si elles sont capables d’utiliser le substrat correspondant. La lecture de ces réactions se fait à l’aide du Tableau de Lecture et l’identification est obtenue à l’aide du Catalogue Analytique ou d’un logiciel d’identification (Joffin et Leyral, 1998). MATERIELS ET METHODES [CHAP 1 : Isolement et caractérisation des microorganismes de différents biotopes] 39 d- Système API 20 Strep (bio Mérieux) L’API 20 Strep est un système standarisé qui permet le diagnostic de groupe ou d’espèce pour la plupart des Streptocoques, Entérocoques et pour les germes apparentés les plus courants. La galerie API20 Strep comporte 20 microtubes contenant les substrats déshydratés pour la mise en évidence d’activités enzymatique ou de fermentation de sucres. Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, réalisée à partir d’une culture pure, qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs. Les tests de fermentation sont inoculés avec un milieu enrichi (contenant un indicateur de pH) qui réhydrate les sucres. La fermentation des carbohydrates entraine une acidification se traduisant par un virage spontané de l’indicateur coloré. La lecture de ces réactions se fait à l’aide du Tableau de Lecture et l’identification est obtenue à l’aide du Catalogue Analytique ou d’un logiciel d’identification (Joffin et Leyral, 1998).

Antibiogramme

L’antibiogramme permet de déterminer la sensibilité d’une bactérie vis-à-vis des antibiotiques. Il est basé sur l’étude de la croissance bactérienne en présence d’un gradient de concentration de l’antibiotique. La détermination de la sensibilité aux antibiotiques est réalisée le plus souvent par diffusion en milieu solide (méthode des disques). La méthode utilisée est celle de Kirby-Bauer (Qin et al., 2004) préconisée par le NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard). Le milieu utilisé est le Mueller Hinton (MH) (Delarras, 1998 ; Hart et Shears, 1999). L’interprétation des résultats a été réalisée selon les recommandations du comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie (Soussy, 2011). Le choix des antibiotiques testés sur les différentes espèces bactériennes isolées, repose d’une part, sur l’identification du genre et son profil habituel vis-à-vis des antibiotiques (résistances naturelles et résistances acquises possibles), et d’autre part, sur le spectre d’activité de chaque antibiotique et son action sur les bactéries à Gram (–) et/ou sur les bactéries à Gram(+) (Grundmann et al., 1993 ; Gray et George, 2000 ; Grare et al., 2010). En plus, les antibiotiques ont été sélectionnés selon leur disponibilité. Les antibiotiques utilisés ont été cités dans le tableau 6

Caractérisation des levures 

Test de filamentation (blastèse)

Candida albicans et Candida dubliniensis sont les seules espèces qui produisent des tubes germinatifs en 3 heures à 37°C, dans un milieu pour blastèse ou dans du sérum. Au-delà de 4 heures, la germination n’est plus spécifique de Candida albicans/Candida dubliniensis, sachant que seul 2% des souches de C. albicans/ C. dubliniensis ne produisent pas de tubes germinatifs. Une suspension homogène d’une colonie de levures obtenues sur milieu de Sabouraud est réalisée dans 0,5 ml de sérum humain ou animal. Après 3 heures d’incubation à 37° C, une goutte de cette suspension est examinée au microscope optique entre lame et lamelle à un grossissement (x10) ou (x40). Le test est positif si environ 50% des levures présentent un « tube de germination » (et non un bourgeonnement) flexueux dont la longueur atteint au moins trois fois celle du diamètre de la levure. (Hart et Shears, 1999 ; Joffin et Leyral, 2006). 

Antifongigramme

L’antifongigramme a été réalisé selon la méthode CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) du comité de standardisation des techniques biologiques à utilisation médicale NCCLS (CLSI, 2008). La CMI est la plus petite concentration d’antifongique qui inhibe toute culture visible d’une souche fongique après 48 heures de culture à 37° C. Dans une série de tubes (macrodilution), on répartit une quantité égale de bouillon sabouraud ensemencé d’un inoculum de concentration connue de la levure à étudier. On distribue ensuite dans les tubes, l’antifongique à tester (le fluconazole) en quantité croissante (0,5, 1, 2, 4 jusqu’à 512 μg/ml). Le tube qui ne reçoit que la levure en suspension constitue le tube témoin (T) sans antifongique. L’ensemble des tubes est mis à l’étuve à 37° C. La croissance microbienne dans chaque tube sera évaluée par rapport au témoin, la concentration qui donne le premier tube clair c’est-àdire pas de croissance fongique, détermine la CMI. Les seuils spécifiques de CMI définissant la sensibilité ou la résistance de Candida par la méthode CLSI ont été définis dans le tableau 7 (Cuenca-Estrella et al., 2005).