Screening phytochimique et évaluation de l’activité
antibactérienne des extraits de racines de
Jatropha chevalieri

Matériel de préparation des extraits 

Le matériel nécessaire pour la préparation des extraits : – Evaporateur rotatif (Buchi) – Broyeur type S1P – Etuve (Memmert) – Agitateur magnétique – Balance de précision (Belengineering) – Verrerie – Réfrigérateur – Entonnoir – Portoir – Spatule – Potence – Eprouvette – Papier aluminium – Ampoule à décanter – Fiole jaugé – Agitateur Vortex – Papier filtre – Coton hydrophile – Capsule à porcelaine 

Matériel végétal

Il s’agit des racines fraiches de J. chevalieri (Euphorbiaceae) obtenu au marché Pakureene de Thiaroye à Pikine. Les racines sont ensuite nettoyées avec de l’eau puis séchées à l’air libre pendant 21 jours (trois semaines) au laboratoire de Chimie Organique et Thérapeutique du Département de Pharmacie de la Faculté de Médecine de Pharmacie et d’Odontologie de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar. Les racines séchées sont ensuite finement pulvérisées (Figure 1) pour l’extraction. Figure 1: Racines de J. chevalieri pulvérisées après 21 jours de séchage. 

 Solvants et Réactifs

 Solvants 

Les extraits cyclohexanique, d’acétate d’éthyle et aqueux ont été obtenus par extractions successives avec des solvants, en fonction de l’ordre croissant de leur polarité. Dans cet ordre, nous avons employé le cyclohexane, l’acétate d’éthyle et l’eau distillée. Les tests de détection des groupes de composés ont portés sur ces 3 types d’extraits bruts. 

 Réactifs

 Le screening phytochimique a nécessité divers réactifs. La recherche des tanins catéchiques a été possible grâce au réactif de Stiasny et à l’acétate de sodium. Pour la caractérisation des tanins galliques, nous avons employé le réactif de Stiasny, l’acétate de sodium et du chlorure ferrique. L’anhydride acétique et l’acide sulfurique concentré ont été nécessaires à la recherche des stérols et polyterpènes. L’alcool chlorhydrique dilué 2 fois et les copeaux de magnésium ont été utilisés pour rechercher les flavonoïdes. La solution alcoolique de chlorure ferrique à 2 % a permis la caractérisation des polyphénols. Nous avons caractérisé les alcaloïdes à partir de l’alcool à 60° et du réactif de Dragendorff (réactif à l’iodo-bismuthate de potassium). 

 Souches bactériennes 

Les souches bactériennes utilisées pour les tests ont été isolées et identifiées au laboratoire de Bactériologie du Centre Hospitalier Universitaire Aristide Le Dantec de Dakar. Les souchesbactériennes sont : Escherichia coli (ACCT 25922), Staphylococcus aureus (ACCT 29213), et Pseudomonas aeruginosa (ACCT 27253). 1.2 Méthodes 

 Extraction 

Les racines de J. chevalierisont séchées au laboratoire à la température ambiante. Elles sont ensuite finement coupées puis broyées grâce à un broyeur type S1P. Pour mener l’étude phytochimique, nous avons réalisé, sur la poudre obtenue, 3 extractions, selon le protocole mis au point par Nemlin et Brunel (18) et repris par N’guessan Koffi et al. (19). Nous avons adapté les quantités de solvants et du produit végétal à cause du faible poids de la poudre obtenue. Les extraits bruts ont été obtenus par extractions successives, avec des solvants de polarités croissantes. Dans cet ordre, nous avons utilisé le cyclohexane, l’acétate d’éthyle, le méthanol et l’eau. Pour l’extraction au cyclohexane, nous avons dissout 5 g de poudre dans 100 ml de cyclohexane. L’ensemble a été homogénéisé par agitation à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 20 min. La mixture a été ensuite filtrée. Le filtrat obtenu a été nommé filtrat cyclohexanique 1. Sur le marc résiduel, nous avons ajouté 100 ml de cyclohexane ; après 20 min d’agitation puis filtration, nous avons obtenu le filtrat cyclohexanique 2. La même opération a permis d’obtenir le filtrat cyclohexanique 3. Ces 3 filtrats ont été regroupés et concentrés à 50 ml par évaporation. Cette série d’opérations a conduit à une solution concentrée que nous avons appelée extrait cyclohexanique. Après épuisement au cyclohexane le marc résiduel a été séché. La poudre obtenue a été récupérée dans 100 ml d’acétate d’éthyle. Vingt (20) min d’homogénéisation par agitation ont permis d’obtenir le filtrat acétate d’éthyle 1. La même opération a étéreprise et elle a donné le filtrat d’acétate d’éthyle 2 et 3. Ces 3 filtrats réunis ont été filtrés et concentrés à 50 ml, pour donner l’extrait d’’acétate d’éthyle. Après épuisement à l’acétate d’éthyle, le marc résiduel a été séché. La poudre obtenue a été récupérée dans 100 ml de méthanol.Selon le même procédé, nous avons obtenu 3 filtrats méthanolique réunis concentrés à 50 ml, au bain de sable, pour donner l’extrait méthanolique. Pour préparer l’extrait aqueux, nous avons infusé 5 g de poudre sèche dans 50 ml d’eau distillée, pendant 15 min. L’infusé a été filtré pour produire l’extrait aqueux.

 Etudes phytochimiques 

Nous avons caractérisé les différents groupes chimiques en nous référant aux techniques décrites dans les travaux de Ronchetti et Russo (20), Hegnauer (21), Wagner (22), Békro et al. (23), N’guessan Koffi et al(19) et celles décrites par Basséne(24). Les stérols et les polyterpènes ont été recherchés par la réaction de Liebermann. Cinq (5) ml de chaque extrait est évaporé à sec dans une capsule à porcelaine. Le résidu est dissout dans 1 ml d’anhydride acétique. La solution est transférée dans un tube à essais. A l’aide d’une pipette, 1 ml d’acide sulfurique concentré est déposé délicatement sur le haut du tube à essais. L’apparition, à l’interphase, d’un anneau pourpre ou violet, virant au bleu puis au vert, indique une réaction positive. La réaction au chlorure ferrique (FeCl3) a permis de caractériser les polyphénols. A 2 ml de chaque extrait, nous avons ajouté une goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique à 2%. L’apparition d’une coloration bleu-noirâtre ou verte plus ou moins foncée est signe de la présence de polyphénols. Cette réaction met également en évidence la présence de tanins. La recherche des tanins catéchiques ou tanins non hydrolysables s’est réalisée à partir du réactif de Stiasny. Cinq (5) ml de chaque extrait ont été évaporés à sec. Après ajout de 15 ml du réactif de Stiasny au résidu, lemélange a été maintenu au bain-marie à 80 °C pendant 30 min. L’observation d’un précipité en gros flocons caractérise les tanins catéchiques. Pour les tanins galliques ou tanins hydrolysables, nous avons filtré la solution précédente. Le filtrat est recueilli et saturé d’acétate de sodium. L’addition de 3 gouttes de FeCl3 provoquerait l’apparition d’une coloration bleu-noir intense, signe de la présence de tanins galliques. Les flavonoïdes ont été recherchés par la réaction de Shibata ou réaction à la cyanidine. Deux (2) ml de chaque extrait sont évaporés à sec dans une capsule à porcelaine. Le résidu est repris dans 5 ml d’alcool chlorhydrique dilué 2 fois. La solution est transférée dans un tube à essais. En ajoutant 2 à 3 copeaux de magnésium, il y a un dégagement de chaleur puis une coloration rose orangée ou violacée. Les alcaloïdes ont été caractérisés par le réactif de Dragendorff (réactif à l’iodobismuthate de potassium). Six (6) ml de chaque solution ont été évaporés à sec. Chaque extrait est repris par 6 ml d’alcool à 60°. L’addition de 2 gouttes du réactif de Dragendorff sur la solution alcoolique devrait provoquer un précipité ou une coloration orangée signe de la présence d’alcaloïdes. Pour rechercher les saponosides, nous avons versé, dans un tube à essai, 10 ml de l’extrait total aqueux. Le tube était agité pendant 15 s puis laissé au repos durant 15 min. Une hauteur de mousse persistante, supérieure à 1 cm indique la présence de saponosides. 

 Tests antibactériens 

 La méthode EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) de diffusion sur gélose a été utilisée pour étudier l’activité antimicrobienne des extraits. Elle est basée sur les principes définis dans le rapport de l’étude collaborative internationale sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens et sur l’expérience de groupes d’experts du monde entier. Les souches pures utilisées sont : Staphylococcus aureus ACCT 29213, Escherichia coli ACCT 25922, Pseudomonas aeruginosa ACCT 27253. 

Préparation du milieu de culture

 La gélose Mueller-Hinton (MH) non supplémentée est utilisée pour les organismes non fastidieux et la gélose MH additionnée de 5% (v / v) de sang de cheval défibriné mécaniquement et de 20 mg / L de b-NAD (MH-F) pour les organismes exigeants. La gélose est distribuée dans des boîtes de Pétri pour atteindre une profondeur uniforme de 4 mm avec une variation maximale de 0,5 mm

 Préparation de l’inoculum et inoculation des géloses

 A partir de colonies, on réalise une suspension bactérienne en solution salée pour atteindre une turbidité équivalente à celle de l’étalon 0,5 de la gamme de Mc Farland, ce qui correspond à un inoculum d’environ 1 à 2×108 UFC/ml pour Escherichia coli. Cette méthode convient pour toutes les bactéries y compris celles à croissance lente. Un coton-tige stérile est plongé dans la suspension d’inoculum et l’excès de liquide est éliminé en le retournant contre l’intérieur du tube pour éviter une sur-inoculation des plaques. L’inoculum est réparti uniformément sur toute la surface de la plaque de gélose, dans trois directions ou à l’aide d’un dispositif de rotation automatique. 

 Dépôt des disques imprégnés d’extraits

 Les extraits cyclohexanique, d’acétate d’éthyle et aqueux ont été utilisés pour imprégner les disques. Le nombre de disques sur une plaque est limité afin d’éviter tout chevauchement inacceptable de zones. Dans les 15 minutes qui suivent l’application des disques, les plaques sont inversées et incubées à une température de 35 ±1 °C pendant 16 à 20 heures. 

Mesure du diamètre des zones d’inhibition

 Après l’incubation, les zones d’inhibition sont lues au point où aucune croissance évidente n’est détectée par l’œil nu lorsque la plaque est maintenue à environ 30 cm de l’œil. Les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés au millimètre près avec une règle, un compas ou un lecteur de zone automatisé. Les plaques de gélose MH non additionnées sont lues à l’arrière de la plaque avec une lumière réfléchie sur un fond sombre, tandis que les plaques de gélose MH-F sont lues de l’avant avec le couvercle retiré et avec une lumière réfléchi. Les diamètres de zone sont interprétés et classés comme sensibles, intermédiaires ou résistants selon les tableaux de points d’arrêt cliniques EUCAST.