Chimie analytique et glycoprotéomique

Les glycanes présents sur les glycoprotéines, en particulier sur les hormones chorioniques gonadotropes hCG et eCG, ont un rôle proéminent dans leur durée de vie et leur élimination, ainsi que dans leurs fonctions effectrices résultant de leur interaction avec les récepteurs membranaires LH/CGR. Ces paramètres chimiques et biologiques sont impactés par la nature exacte des structures polysaccharidiques, c’est-à-dire leur composition, leur stéréoisomérie, leur site de liaison à la protéine, et la microhétérogénéité de ces glycohormones. La diversité des glycoformes présentes au sein d’un individu pourrait aussi avoir un rôle dans l’activité globale des secrétions hormonales. On distingue généralement trois niveaux d’analyse des glycoprotéines (Figure 14), selon qu’elle soit faite sur la molécules intacte (approche top-down), sur les glycopeptides issus de la dégradation chimique ou enzymatique de la protéine (approche bottom-up), ou uniquement sur les sucres après rupture de leur liaison à la protéine (glycomique). En effet, la dégradation des glycoprotéines permet de réduire la taille des molécules analysées et diminue ainsi leur complexité structurale et augmente les performances des outils analytiques disponibles. Cependant, ces étapes de traitement visant à diminuer la complexité structurale des échantillons provoque également la perte d’information, potentiellement biologiquement pertinente, quant à l’effet combiné de ces différentes glycosylations entre elles, ou avec d’autres types de modifications.

Il semble donc judicieux de conserver ces approches  Bien que représentant un pan important de la glycoprotéomique, les études biologiques ou pharmacologiques des glycanes et de leurs dérivés ne seront pas approfondies dans le présent manuscrit. En effet, ces techniques très informatives permettant en particulier d’explorer la fonctionnalité des glycoconjugués sont généralement dissociées d’analyses focalisées sur la caractérisation structurale des glycanes. Plusieurs approches analytiques sont capables d’identifier les glycanes et glycoconjugués sur la base de la caractérisation des éléments structuraux de ces molécules. Les lectines sont une famille de protéines présente chez tous les organismes reconnaissant certains traits structuraux des glycanes. Ces protéines et les immunoglobulines sont souvent utilisées comme outil pour la caractérisation des glycanes grâce à leur très grande spécificité et à leur grande diversité. Conjuguées à des éléments détectables (fluorochromes…), les différentes espèces de lectines permettent d’identifier les familles de N-glycanes et cores O- glycosidiques, la présence d’acides sialiques terminaux, de GlcNAc bissectrice ou de fucose, et donc virtuellement la plupart des glycanes. L’utilisation de protéines reconnaissant les motifs glycosylés est d’intérêt majeur mais est parfois limitée par la faiblesse de l’interaction glycane-lectine (46) ou par l’indisponibilité de protéine dirigée vers des formes de glycanes moins communes (47).

La résonance magnétique nucléaire (RMN) permet une analyse stéréochimique, non-destructive et sans connaissance préalable de la structure étudiée. Elle permet la caractérisation structurale au niveau de glycoprotéines intactes (48), ainsi que pour l’étude d’interactions glycane-récepteur (49,50). De plus, cette technique est relativement tolérante vis-à-vis d’une large diversité de molécules en termes d’acidité ou d’hydrophobie et est intrinsèquement quantitative. La RMN nécessite cependant des échantillons faiblement hétérogènes, rendant souhaitable l’utilisation de méthodes de séparation ou de La spectrométrie de masse (MS) permet de contourner certaines de ces limitations. Elle propose une meilleure sensibilité que la RMN et permet la détection d’un nombre important de structures réparties sur une grande gamme de concentrations, tout en pouvant être couplée à des méthodes de séparations en phase liquide ou gazeuse. L’utilisation de la spectrométrie de masse en tandem permet la caractérisation de la composition et de la séquence des glycanes, de leur site de liaison à la protéine ainsi que l’identification de celle-ci. Mais la spectrométrie de masse fait également face à certains verrous, en particulier quant à la nature des composés analysables, nécessairement ionisables et souvent hydrophobes. De plus, la quantification en spectrométrie de masse nécessite des méthodes de normalisation relativement complexes à mettre en œuvre. L’étude des glycanes et des glycoconjugués par spectrométrie de masse est un domaine de recherche en constante évolution, tant au niveau instrumental que d’un point de vue méthodologique.

L’objectif de cette partie est de présenter l’état des avancées techniques dans ce domaine afin de resituer la pertinence du travail de recherche entrepris. 2.1 Introduction à la spectrométrie de masse La spectrométrie de masse (MS) est une technique de chimie analytique développée au long du XXème siècle, basée sur la mesure du rapport masse / charge (m/z) de molécules ionisées à l’état gazeux par un spectromètre de masse. On peut généralement schématiser ces appareils par la combinaison de quatre éléments : une source d’ionisation, un (ou plusieurs) analyseur(s), un système de détection et d’enregistrement du signal (Figure 15). Un spectromètre de masse peut être utilisé indépendamment, généralement pour des molécules purifiées ou des mélanges peu complexes, ou être couplé à des méthodes séparatives, en couplage direct (online) ou indirect avec collecte de fractions (offline).