CO – CONCEPTION POUR LA LOCALISATION DE MOLÉCULES UNIQUES

La microscopie par super-localisation de molécules uniques est devenue un outil incon- tournable pour étudier les structures et dynamiques d’échantillons biologiques avec une résolution nanométrique, bien au-delà de la limite de diffraction. Pour maximiser la pré- cision de localisation, les objectifs de microscope utilisés doivent avoir une ouverture nu- mérique élevée ; cependant, cette caractéristique limite fortement la profondeur de champ (PdC) des images acquises. Dans ce chapitre et les suivants, nous utilisons l’approche de « co-conception optique – traitement », présentée aux chapitres précédents, pour optimiser et comparer des masques de phase, qui, lorsqu’ils sont placés dans la pupille de sortie de l’objectif du système d’ima- gerie, peuvent augmenter la PdC des techniques de microscopie par localisation. En uti- lisant un critère basé non plus sur la qualité d’image mais sur la précision de localisa- tion, construit à l’aide de la borne de Cramér-Rao (BCR), nous optimisons des masques de phase binaires annulaires pour imager des échantillons biologiques épais. Nous carac- térisons leurs performances et les comparons à celles présentées dans la littérature. Nous proposons ensuite un algorithme de localisation basé sur le maximum de vraisemblance, facile à mettre en œuvre, et pouvant atteindre la précision de localisation prédite par la BCR.

Avec le développement de marqueurs fluorescents photo-activables, la microscopie par localisation (SMLM) consiste à imager individuellement des marqueurs fluorescents fixés sur l’objet d’intérêt puis à estimer avec une très grande précision — de l’ordre du nanomètre — leur position. Deux principes distincts de cette technique d’imagerie ont été récompensés par le prix Nobel de Chimie en 2014 à imager plusieurs fois la même zone dans laquelle des marqueurs fluorescents individuels sont activés puis désactivés. Nous nous concentrerons dans la suite du manuscrit sur ce mode d’imagerie, dont le schéma de principe est décrit en Figure 3.2. Betzig et al. [2006], Hess et al. [2006], Rust et al. [2006], Sharonov et Hochstrasser [2006] ont été les premières équipes à utiliser cette méthode. Une précision de localisation de l’ordre du nanomètre permet d’observer le compor- tement dynamique et précis de molécules, ou de leurs ensembles, dans des environne- ments biologiques complexes tels que des cellules vivantes (voir par exemple les travaux de Cognet et al. [2014]) ou des matériaux structurés (voir par exemple les travaux de Kir- stein et al. [2007], Lasne et al. [2008], Godin et al. [2017]).lement pas confinés dans les deux dimensions du plan focal. Plusieurs approches ont donc été développées pour étendre le concept de super-localisation à la troisième di- mension (voir par exemple les travaux de Hajj et al. [2014]). Elles reposent sur l’utilisa- tion d’un masque de phase pour modifier la PSF. On peut citer deux exemples connus : les PSF à double hélice [Pavani et Piestun, 2008b] et les tétrapodes [Shechtman et al., 2014]. La localisation 3D de marqueurs fluorescents s’est avérée très efficace sur la plage de PdC naturelle des microscopes, et dans des échantillons biologiques épais [Bon et al., 2018, Xu et al., 2020]. Mais ces techniques nécessitent des dispositifs, un étalonnage, et des traitements numériques sophistiqués.

Étendre la PdC sans chercher à localiser les marqueurs le long de l’axe optique estutile dans certaines applications comme l’imagerie à haute vitesse (avec un faible nom- bre de photons) ou lorsque la super-localisation dans la troisième dimension est réa- lisée autrement, par exemple, par modulation du signal de fluorescence [Jouchet et al., 2019] ou par interférométrie [Bon et al., 2018]. L’extension de la PdC en imagerie 2D peut permettre de diminuer la complexité instrumentale et le traitement numérique associé. Plusieurs travaux ont été proposés pour rendre invariante la PSF du microscope le long de l’axe optique, et ainsi générer des images volumétriques par projection 2D d’un vo- lume imagé [Abrahamsson et al., 2006, Zahreddine et Cogswell, 2015, Ren et Han, 2021]. Ce concept a également été utilisé en microscopie par excitation à deux photons pour masques de phase permettant d’étendre la PdC des microscopes par localisation. Cette approche s’inspire de la « co-conception optique – traitement », introduite au Chapitre 2, qui prend en compte à la fois le modèle d’imagerie, les propriétés du système optique et le traitement numérique appliqué aux images acquises, pour optimiser la qualité des informations finales délivrées par le système (i.e., la position des fluorophores). Nous proposons ainsi un cadre rigoureux (basé sur l’information de Fisher) pour optimiser et comparer les masques de phase améliorant la précision de localisation 2D sur une plus grande PdC. Le potentiel de cette approche est illustré, en fin de chapitre, en co- optimisant et en comparant les performances des masques de phase binaires annulaires avec ceux proposés par Abrahamsson et al. [2006].