Complément d’analyse de la fraction de protéines membranaires

Nous avons recherché dans l’ensemble des protéines identifiées celle qui étaient intrinsèquement membranaires c’est à dire susceptibles de contenir des segments transmembranaires avec une version du logiciel, HMMTOP (Tusnady et al., 2001) modifiée par le Laboratoire d’Etude Dynamique des Protéomes (CEA de Grenoble) pour traiter plusieurs séquences protéiques simultanément. Les résultats ont montré qu’environ 70 % des protéines identifiées au cours de ces analyses ne présentent pas de domaine transmembranaire (figure 4.10). Bon nombre de ces protéines sont cytoplasmiques et sont certainement piégées dans des vésicules membranaires lors de la lyse des cellules. De plus, parmi ces protéines membranaires, il y a beaucoup de protéines liées à la membrane, qui n’ont pas de segments transmembranaires mais qui ont une nature hydrophobe. L’analyse ne nous permet pas de le savoir. 

Limites de la méthode

 L’analyse protéomique mise en oeuvre a conduit à l’identification de plus 1300 protéines ce qui est remarquable compte tenu du fait que le génome de la bactérie n’est pas connu. La méthode d’identification et de quantification des protéines a toutefois ses limites : • Lors de l’identification des protéines par le logiciel MASCOT, les peptides qui ne correspondent à aucune protéine présente dans les bases de données ne sont pas pris en compte. Bien que les bases de données soient de plus en plus riches en séquences de génomes bactériens, on peut rater une protéine d’intérêt au cours de l’analyse. Par exemple, certains spots 2D n’ont pas pu être identifiés. • Lors du calcul du PAI (Protein Abudance Index), on estime une abondance relative des peptides et on en déduit une abondance relative de protéine. Cette estimation n’est pas tout à fait juste même si les appareils utilisés pour l’analyse sont très performants. Par exemple, il peut y avoir des isoenzymes avec un ou plusieurs peptides en commun. Parmi ces dernières, on ne retiendra que celle qui a le meilleur score et le meilleur taux de recouvrement. Il est alors possible d’écarter, au niveau de la synthèse des résultats, d’autres identifications de ces protéines. Il peut alors y avoir un léger biais. • Le calcul du spectral count est a priori plus juste puisque nous utilisons le nombre de spectres obtenus dans l’analyse, qui dépend de l’abondance des peptides. Mais nous faisons toujours une approximation entre le résultat de l’analyse des peptides et la quantification des protéines. 

La découverte de P450 alcane monooxygénase de type CYP153 chez la souche IFP 2173 

Au cours de l’analyse d’une bande à 47 kDa, correspondant à une protéine marquée au 35S, quatre cytochromes P450 ont été identifiés sur quarante protéines au total, dont un ressemblait à une alcane hydroxylase de type CYP153. Ce cytochrome est différent de la cinquantaine de P450 de M. vanbaalenii PYR-1, mais possède une séquence très proche du CYP153A de Mycobacterium sp. HXN-1500 trouvée par van Beilen et al. (2005b). Ce cytochrome a été largement étudié par Funhoff et al. (2006), tous les détails de son analyse figurent dans l’étude bibliographique pages 26 à 31. Ce cytochrome est soluble mais des prédictions de séquence indiquent une région hydrophobe qui pourrait se lier à la membrane, ce qui expliquerait pourquoi il est retrouvé dans la fraction membranaire.Ce CYP153 se retrouve parmi les protéines exclusivement produites sur 2-EHN. De par son classement en fonction de son abondance relative (40 ème position sur un total de 899 protéines), c’est la deuxième protéine spécifique la plus abondante. Son rôle dans la dégradation du 2-EHN a été étudié dans la dernière partie des résultats.  

Étape initiale de dégradation du 2-EHN 

L’étude protéomique des enzymes potentiellement impliquées dans la dégradation du 2- EHN a permis de mettre en évidence une alcane mono-oxygénase. Il s’agit d’un cytochrome P450 de type CYP153. Lors d’études antérieures sur M. austroafricanum IFP 2173, une alcane hydroxylase de type AlkB a été identifiée. Elle serait impliquée dans la dégradation de l’isooctane (Solano-Serrena et al., 2004). A partir de l’analyse de séquences de génomes de mycobactéries récemment publiées, j’ai cloné et obtenu la séquence complète du gène alkB1 codant pour l’alcane hydroxylase membranaire de M. austroafricanum IFP 2173 et j’ai trouvé un second gène codant pour une alcane hydroxylase appelée alkB2. Afin d’étudier les propriétés de ces enzymes, j’ai entrepris leur expression en système recombinant pour savoir si l’une d’elles était impliquée dans l’étape initiale de dégradation du 2-EHN. 4.1 Les alcane hydroxylases de type alkB 

Le gène alkB1

 A l’origine, ce gène a été trouvé et en partie séquencé par Floriane Solano-Serena et al. lors de l’étude de la dégradation de l’iso-octane par la souche IFP2173. Le numéro d’accession est AAQ88276. Nous disposions donc d’une séquence partielle qui correspondait parfaitement à l’alcane mono-oxygénase Mvan_1742 de M. vanbaalenii PYR-1. Sur la base de cette information de séquence et des séquences des gènes Mvan_1741, Mvan_1743, Mvan_1744, Mvan_1745 et Mvan_1747, j’ai conçu des oligonucléotides pour amplifier les gènes correspondants de la souche IFP 2173, ainsi que les gènes voisins. Les conditions de PCR ont nécessité l’ajout de DMSO à hauteur de 5 %, en raison de la séquence riche en GC et/ou de structures de l’ADN (tiges-boucles) susceptibles de gêner la réplication par l’ADN polymérase. Après avoir purifié les produits PCR de taille attendue, je les ai clonés dans un vecteur commercial (pDrive) et les ai fait séquencés (Génome Express ; Meylan 38). La taille des fragments PCR obtenus ainsi que les gènes qu’ils contenaient sont indiqués dans les figures 4.11 et 4.12. Le tableau 2.3b dans Matériel et Méthodes liste les plasmides construits dans cette étude (page 58). Le gène alkB1, composé de 1271 pb, fait partie d’un groupe de gènes comprenant aussi deux gènes de rubrédoxines, nommées rubA1 (174 pb) et rubA2 (183 pb). Les gènes rubA1 et rubA2 sont dans la même phase de lecture que le gène alkB1. Ils sont enchevêtrés au gène qui les précède par une séquence GTGA. Dans les deux cas, le codon start est GTG pour gènes  rubA1 et rubA2 et le codon stop est TGA pour le gène précédant. Il n’y a pas de gène codant pour une rubrédoxine réductase comme c’est le cas pour l’opéron de Pseudomonas putida Gpo1 (van Beilen et al. 2003). Seules 31 bases séparent ces trois gènes de celui codant un facteur de transcription, nommé tetR (732 pb). Nous avons inclus dans le fragment amplifié par PCR une séquence non codante de 345 pb en amont du gène alkB1 susceptible de contenir la région promotrice. L’organisation et la séquence nucléique de cet ensemble de quatre gènes sont très proches de celles trouvées dans la région correspondante du génome de M. vanbaalenii PYR-1 (98 % d’identité de séquence) (Figure 5.11).

 Le gène alkB2

vanbaalenii PYR-1 possède un autre gène qui code pour une autre alcane monooxygénase. J’ai eu accès via la base de donnée NCBI, à la séquence de ce gène Mvan_3100 ainsi qu’à celles des gènes voisins Mvan_3099 et Mvan_3101, à partir desquelles j’ai conçu des oligonucléotides pour amplifier les gènes correspondant de M. austroafricanum IFP 2173. J’ai obtenu par PCR un produit d’environ 2600 pb. L’analyse de la séquence a montré que la séquence du fragment cloné de la souche IFP 2173 était à 99 % identique à la région homologue de M. vanbaalenii PYR-1. Ainsi, le gène trouvé code potentiellement pour une alcane mono-oxygénase et je l’ai appelé alkB2 (1185 pb). L’analyse a aussi montré la présence d’un gène homologue à Mvan_3101 en aval de alkB2, qui code pour une « short chain dehydrogenase ». Une illustration du locus contenant le gène alkB2 est représentée par la figure 4.12.