Destruction du microenvironnement tumoral par
application de forces mécaniques exercées par des
nanoparticules magnétiques

Cancer et microenvironnement tumoral

Le cancer 

Caractéristiques essentielles du cancer

 Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anarchique au sein d’un tissu, jusqu’à apparition d’une tumeur. Les cellules tumorales dérivent d’une même cellule initiatrice et possèdent des particularités liées à l’accumulation d’altérations de leur génome. Ces altérations se font au niveau de proto-oncogènes ou bien d’anti-oncogènes (appelés également gènes suppresseurs de tumeurs). Les proto-oncogènes sont définis comme étant des gènes susceptibles de devenir transformants, c’est-à-dire capables de conférer expérimentalement le phénotype cancéreux à une cellule normale eucaryote, lorsque leurs altérations sur-activent leur fonction d’origine. Ils deviennent alors des oncogènes. Les proto-oncogènes codent en général : des facteurs de croissance (ex : Fibroblast Growth Factor, FGF), des récepteurs transmembranaires de facteurs de croissance (ex : récepteur à l’EGF, Epidermal Growth Factor), des protéines G ou protéines membranaires liant le GTP, des tyrosines protéine-kinases membranaires, des protéine-kinases cytosoliques, des protéines à activité nucléaire (fos, jun, c-myc, erbA). Les anti-oncogènes/gènes suppresseurs de tumeurs sont quant à eux des gènes qui, dans les conditions normales, contrairement aux proto-oncogènes, ne favorisent pas la prolifération cellulaire mais la régulent négativement. Leurs fonctions initiales sont d’inhiber le cycle cellulaire à une étape précise (ex: p53), ou de favoriser l’apoptose (ex: Bim). Ainsi les mutations diminuant ou éliminant leurs fonctions sont transformantes, menant à l’apparition de cancers. Les cellules cancéreuses peuvent perdre, conserver, ou acquérir des caractéristiques aux cours des divisions cellulaires, ce qui confère aux cellules d’une même tumeur une assez grande diversité génétique. 5 Les propriétés suivantes sont inhérentes aux cellules cancéreuses [1] : – la perte d’homéostasie : contrairement aux cellules normales elles n’ont plus besoin de stimulus pour entrer en division cellulaire et sont donc indépendantes vis-à-vis des signaux qui stimulent la prolifération. – l’immortalité : elles sont insensibles aux signaux et mécanismes antiprolifératifs. – une capacité proliférative illimitée : une cellule saine peut se diviser 50 à 60 fois maximum tandis qu’une cellule cancéreuse peut se diviser à l’infini. – une capacité à provoquer l’angiogenèse : les cellules cancéreuses peuvent stimuler la formation de vaisseaux sanguins dans la masse tumorale à partir de vaisseaux préexistants au voisinage de la tumeur. Les vaisseaux formés permettent l’apport d’oxygène et de nutriments nécessaires au développement de la tumeur [2]. – l’acquisition d’un pouvoir invasif : Les cellules tumorales possèdent la capacité d’envahir les tissus environnants. Ceci passe en partie par la perturbation des mécanismes d’adhésion cellulaire [3], par exemple par la désactivation ou la diminution de l’expression de molécules d’adhésion [4]. Puis, en migrant et en circulant à l’intérieur des vaisseaux sanguins elles peuvent se disséminer dans l’organisme et former d’autres tumeurs, appelées des métastases. Lorsque seules les trois premières caractéristiques précédemment citées ont été exploitées par les cellules cancéreuses, et qu’elles prolifèrent au sein d’un tissu, le cancer est une masse de cellules qui survit dans l’organisme. Après le début de l’angiogenèse, la tumeur grossit jusqu’à atteindre la lame basale. Si la croissance tumorale continue et que la membrane basale se rompt, le cancer devient invasif. Les cellules cancéreuses se détachent, migrent et forment des métastases. Les différentes caractéristiques listées ci-dessus sont depuis un certain temps utilisées pour décrire le cancer. Néanmoins, d’autres tentatives de caractérisation ont depuis été proposées, en ajoutant les connaissances acquises par la communauté scientifique. Ainsi, une publication de Yousef Ahmed Fouad et Carmen Aanei liste le cancer comme étant caractérisé par : une croissance sélective et un avantage prolifératif, une réponse au stress altérée favorisant la survie globale, la vascularisation, l’invasion et les métastases, une modulation métabolique, une modulation immunitaire, et pour finir un microenvironnement adjuvant . 

Le cancer du pancréas

 Epidémiologie et traitements 

La majorité des tumeurs malignes du pancréas sont des adénocarcinomes. Ils représentent à eux seuls 90% des tumeurs pancréatiques non endocrines. L’adénocarcinome canalaire pose un problème de santé majeur, avec environ 367 000 nouveaux cas diagnostiqués dans le monde en 2015 et 359 000 décès la même année. En 2018, l’incidence du cancer du pancréas dans sa globalité était de 456 000 pour environ 430 000 décès [6]. C’est l’une des tumeurs solides les plus agressives et les plus meurtrières. Les statistiques de survie n’ont pas changé depuis une décennie : la plupart des patients survivent peu à la première année suivant le diagnostic et le taux de survie sur 5 ans avoisine les 7%. Le cancer du pancréas est associé à un très mauvais pronostic pour plusieurs raisons : – il est généralement diagnostiqué à un stade avancé, ce qui est souvent dû à des symptômes non spécifiques voire à une maladie asymptomatique (plus de 80% des patients se voient diagnostiqués tardivement). – aucun marqueur tumoral sensible et spécifique n’est identifié et il est difficile de détecter par imagerie les tumeurs à un stade précoce. – il est agressif et présente des métastases précoces qui empêchent la résection chirurgicale curative chez la plupart des patients. – il se caractérise par une forte résistance à la plupart des options de traitement conventionnelles, notamment la chimiothérapie et la radiothérapie – il présente de multiples altérations génétiques et épigénétiques et des microenvironnements tumoraux complexes et denses. Actuellement pour traiter le cancer du pancréas, la chirurgie est proposée seulement lorsque le diagnostic est posé suffisamment tôt, et en l’absence de métastases. La localisation, la taille de la tumeur, et l’état général du patient sont également pris en compte avant de réaliser l’acte. Seuls 10 à 20% des cancers du pancréas exocrine correspondent à ces critères. Dans le cas contraire, la chimiothérapie est préconisée, soit seule soit combinée à de la radiothérapie. Les différentes molécules généralement utilisées pour la chimiothérapie, seules ou associées, sont la gemcitabine, le 5-FU (5-Fluorouracile), l’irinotécan, l’oxaliplatine et le nab-paclitaxel. Parfois, une radiothérapie est proposée en cas de tumeur non opérable mais sans métastases à distance.Les effets secondaires des traitements anticancéreux sont en partie dus à leur manque de spécificité, car ils endommagent également des cellules saines. Une augmentation de la spécificité des traitements permettrait à la fois de diminuer les effets secondaires, mais également d’augmenter l’efficacité de ces traitements. Par conséquent de nombreux travaux ont été menés afin de mettre en lumière des cibles potentielles permettant cette augmentation de la spécificité. Dans le cas du cancer du pancréas, un certain nombre de chercheurs ont travaillé entre autre sur les récepteurs à la cholécystokinine. I.1.2.b- Expression des récepteurs à la cholécystokinine Un grand nombre de preuves indiquent que la cholécystokinine et la gastrine, deux agonistes des récepteurs à la cholécystokinine (RCCKs) agissent en tant que facteurs de croissance et d’invasion via l’activation de leurs récepteurs, favorisant ainsi le développement et la progression des cancers. Plusieurs études visant à la détermination des niveaux d’expression des RCCKs dans les tumeurs humaines ont été rapportées, et la surexpression de ces récepteurs dans le cancer du pancréas a notamment été mise en évidence (cf. partie I.1.2.b-B) ci-dessous)  A) Généralités sur les RCCKs et leur fonctionnement Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une grande famille de récepteurs qui détectent des molécules à l’extérieur de la cellule et activent des voies de signalisation menant à des réponses cellulaires. Les récepteurs à la cholécystokinine appartiennent à la sousfamille A (selon la classification de Kolakowski) de cette famille de récepteurs, autrement appelée la famille des récepteurs “rhodopsins-like”. Deux profils pharmacologiques différents ont été identifiés chez les RCCKs. En se basant sur leur localisation dans l’organisme, le premier fut nommé RCCK-A pour Alimentary, et le second RCCK-B pour Brain. Néanmoins, même si on les trouve encore parfois sous ces dénominations, le comité de l’Union Internationale de Pharmacologie (IUPHAR) recommande les appellations suivantes : le RCCK-A a été renommé RCCK1, et le RCCK-B, RCCK2 [8]. Un troisième récepteur est parfois décrit, mais il s’agit d’un un variant d’épissage du RCCK2. Le RCCK1 et le RCCK2 sont homologues à environ 48%. 8 Les RCCKs diffèrent par leurs distributions tissulaires dans les tissus sains. En effet, le RCCK1 est majoritairement localisé en périphérie tandis que le RCCK2 est préférentiellement exprimé au niveau du cerveau [9]. Comme ces deux récepteurs appartiennent à la famille des RCPG, ils présentent sept segments hydrophobes, correspondant à sept domaines transmembranaires. Leur extrémité Nterminale est extracellulaire et leur extrémité C-terminale, intracellulaire (Fig.1). Le site de liaison des récepteurs de la sous famille A se présente sous la forme d’une cavité créée par les domaines transmembranaires où vient se loger le ligand. Figure 1- Représentation schématique d’un RCCK et de ses domaines transmembranaires Le RCCK1 et le RCCK2 sont internalisés dans la cellule quelques minutes après leur stimulation par un agoniste [10], [11]. L’endocytose de ces récepteurs est dite dépendante de la clathrine (Fig.2). Cette internalisation passe par une invagination de la membrane formant des structures spécialisées appelées les puits recouverts de clathrines. Ces mêmes clathrines qui servent à l’invagination de la membrane recrutent des molécules de dynamine-GTP qui en se polymérisant forment un anneau permettant d’étrangler la membrane plasmique et ainsi de finir de former la vésicule. L’hydrolyse du GTP conduit au changement conformationnel de l’anneau provoquant la déconstruction du manteau de clathrine, de l’anneau, et le relargage de la vésicule dans le cytoplasme. Les différentes vésicules d’endocytose fusionnent ensuite pour former un compartiment de forme irrégulière nommé endosome précoce, où s’effectue le tri entre les récepteurs destinés au recyclage et ceux destinés à la dégradation [12]. Cet adressage se fait en fonction de la nature du récepteur mais également en fonction de celle du ligand. Ceux destinés au recyclage sont réadressés à la membrane via des endosomes de recyclage, reconnaissables par leur forme de tubules interconnectés. L’endosome précoce contenant les récepteurs destinés à la dégradation Membrane Extracellulaire Intracellulaire NH2 COOH 9 se transforme tout d’abord en endosome tardif, un compartiment de pH 6.5 caractérisé par de nombreuses invaginations et des vésicules internes. Cet endosome se transforme ensuite en lysosome (ou lysosome secondaire) dans lequel il sera dégradé. Ces transformations progressives se font via la fusion avec des lysosomes dits primaires (vésicules remplies d’hydrolases) issus du réseau trans-golgien. Au cours de ces transformation le compartiment vésiculaire s’acidifie (jusqu’à un PH=4/5) sous l’action d’une pompe H+ –ATPase type V. En ce qui concerne les ligands, lors du passage dans les endosomes de tri, ils sont la plupart du temps séparés du récepteur (s’ils ne le sont pas le récepteur est détruit) et sont adressés à certains compartiments cellulaires selon leur nature. Figure 2- Représentation schématique de l’internalisation d’un RCCK. 1) Désensibilisation du récepteur via sa phosphorylation par des kinases 2) Endocytose dépendante de la clathrine, formation d’un puits et étranglement de la vésicule par un anneau de dynamine 3) Formation d’un endosome précoce 4a) Recyclage du récepteur 4b) Dégradation dans les lysosomes L’utilisation d’un agoniste, comme la cholécystokinine ou la gastrine, pour le ciblage des RCCKs entraine donc son internalisation dans les cellules. Il est également possible d’utiliser un antagoniste ne stimulant pas l’internalisation ou encore de mettre au point un anticorps ciblant le récepteur. 10  B) Présence et implications des récepteurs dans le cancer du pancréas En plus de leur mode de fonctionnement, les recherches sur les RCCKs ont permis de mettre en lumière leur surexpression dans le cancer du pancréas er leur implication dans son développement. En effet, un certain nombre d’études ont montré que le RCCK1 mais aussi le RCCK2 sont surexprimés dans le cancer du pancréas humain [13]–[16]. Dans les tissus sains du pancréas en revanche, le récepteur CCK2 est présent mais en faible densité comparativement aux tissus cancéreux[17]. Le RCCK2 est surexprimé dans les vipomes tandis que le RCCK1 y est rare [18]. Les RCCKs ont un rôle dans la progression des lésions PanIN car, lorsque ces récepteurs sont bloqués par un antagoniste (proglumide), la fréquence de ces lésions est moins élevée dans le modèle murin [19]. La gastrine, un agoniste des RCCKs, est exprimée durant la carcinogénèse pancréatique dans les lésions pré-néoplasiques et néoplasiques [20], [21] et est surexprimée chez l’homme dont elle régule la croissance du cancer pancréatique par un mécanisme autocrine [22]–[24]. Quand l’expression de la gastrine est inhibée par un ARN interférent, la croissance du cancer du pancréas est diminuée ainsi que le nombre de métastases [25]–[27]. De la même manière, si l’expression RCCK2 est inhibée [28] ou si tous les RCCKs sont bloqués avec un antagoniste [15], la croissance du cancer pancréatique est ralentie. La gastrine et la CCK stimulent la croissance du cancer pancréatique via des récepteurs CCK [15], [29]. Cependant il semble que seul le RCCK2 et son variantsont responsables de la croissance des adénocarcinomes pancréatiques [17]. De plus il semble que l’expression de ce récepteur puisse mener à l’apparition de cancers [21]. Malgré toutes les études menées à ce sujet, les rôles exacts joués par les RCCK1 et RCCK2 dans la carcinogénèse pancréatique humaine sont encore flous et nécessitent d’autres études pour être déterminés plus précisément. Néanmoins, ces récepteurs pourraient constituer de bonnes cibles pour des traitements anticancéreux visant les cellules tumorales pancréatiques. Comme nous l’avons évoqué dans la partie 1.1, le cancer n’est pas seulement caractérisé par ses cellules dites cancéreuses, mais également par le microenvironnement adjuvant qui les entoure. Il semble donc primordial de comprendre les interactions entre le microenvironnement tumoral et les cellules cancéreuses, mais aussi de trouver des cibles en son sein permettant de réduire son influence dans le développement de la tumeur.

Les microenvironnements non pathogène et tumoral 

Le microenvironnement non pathogène

 Le microenvironnement est l’environnement immédiat qui entoure une cellule, un groupe de cellules, ou un tissu, et qui participe à son développement mais également à son maintien architectural et fonctionnel. Le microenvironnement est complexe, pluriel et dynamique. Il est principalement composé de vaisseaux sanguins, de cellules du système immunitaire, de fibroblastes, de facteurs solubles sécrétés par les cellules (chimiokines, facteurs de croissance, hormones, enzymes…), d’adipocytes et de matrice extracellulaire (MEC). La MEC est composée de différents éléments formant un maillage tridimensionnel : des macromolécules formant un gel hydraté (acide hyaluronique, protéoglycanes), des protéines fibrillaires (collagènes, élastines) et des protéines structurales (laminines, fibronectines). Les propriétés physiques de la MEC (sa rigidité, sa porosité, son agencement spatial et son orientation ou topographie) sont déterminantes pour son rôle de maintien structurel et fonctionnel des tissus. Ces propriétés contrôlent également des voies de prolifération, de différenciation et de signalisation des cellules. Les propriétés biochimiques de la MEC permettent des interactions entre les cellules et leur environnement. En régulant la biodisponibilité et la distribution des facteurs de croissance, la MEC crée des gradients internes au sein d’un tissu, établit des surfaces d’adhésion et forme des barrières de diffusion entre les couches cellulaires [30]. Grâce à sa résistance à la traction, à sa capacité de compression et à son élasticité, la MEC assure la protection des cellules qu’elle entoure en jouant le rôle de tampon, maintenant l’homéostasie extracellulaire et la rétention d’eau. Les différents types cellulaires présents interagissent avec la MEC pour garder une localisation précise dans le microenvironnement ou à l’inverse pour se déplacer dans celui-ci. La composition et la structure de la MEC sont adaptées précisément aux besoins des cellules environnantes grâce à la libération de facteurs solubles tels que les facteurs de croissance et les chimiokines . Les facteurs solubles ont eux aussi un rôle essentiel dans la modulation du microenvironnement. Ils peuvent activer des voies de signalisation modifiant l’expression de protéines contrôlant par exemple le cycle cellulaire, la morphologie de la cellule, ou bien son ancrage à la MEC. Ils peuvent également recruter des cellules du système immunitaire ou encore initier et réguler l’angiogenèse. Les fibroblastes (également appelés cellules de soutien) sont des cellules fusiformes ou étoilées avec de longs prolongements cytoplasmiques, très aplaties et allongées. Elles sont présentes au niveau des tissus conjonctifs et ont pour fonction principale de maintenir l’intégrité structurale de ces tissus en sécrétant des macromolécules de la MEC. Les fibroblastes jouent également un rôle important dans les processus de cicatrisation et sont parmi les premiers acteurs initiant les mécanismes d’inflammation. Ils synthétisent des macromolécules de la MEC et produisent d’autres molécules telles que les cytokines et les facteurs de croissance .

Le microenvironnement tumoral dans la carcinogénèse 

Le microenvironnement tumoral est donc l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses, et qui interagit avec elles (Fig.3). Figure 3- Représentation schématique d’une tumeur et de son microenvironnement En 1889, le chirurgien Stephen Paget suggère une théorie, la théorie du « seed and soil », afin d’expliquer la distribution des métastases dans les organes. En effet, il observe que celleci ne se fait pas aléatoirement : après migration les cellules cancéreuses (représentées par le concept de graine, « seed ») s’implantent et croissent préférentiellement dans des localisations spécifiques (représentées par le concept de sol, « soil »). C’est la première fois que le concept 13 de microenvironnement tumoral est évoqué, et que son rôle est décrit comme essentiel au développement de la pathologie. Depuis, il a été démontré que le microenvironnement tumoral joue en effet un rôle capital dans le développement d’un cancer [33]. Le caractère invasif d’une tumeur a longtemps été considéré comme étant le fait des génotypes des cellules tumorales qui la composent. Les cancers étaient d’ailleurs seulement considérés comme des maladies hétérogènes issues de mutation diverses menant à des cellules cancéreuses. Désormais, il est également établi que le microenvironnement tumoral joue un rôle important dans le développement d’un cancer : il participe à la croissance des vaisseaux sanguins (angiogenèse), à la progression de la tumeur, et à sa propagation [34]. Il est également évident que la diversité des tumeurs est liée de surcroit à la diversité de la composition de leurs microenvironnements ; c’est-à-dire aux différentes proportions des différents types cellulaires qui le composent, aux états d’activation des cellules, etc…[1] Ainsi les composants principaux du microenvironnement tumoral sont modifiés par rapport à ceux d’un microenvironnement dit sain. Leurs propriétés sont altérées et exploitées par les cellules cancéreuses qui s’en servent et les détournent pour assurer leur propre survie.

Rôles et particularités des composants du microenvironnement tumoral  

Les vaisseaux 

Les cellules vasculaires sont des cellules endothéliales qui forment les capillaires sanguins ou lymphatiques, ainsi que les veines et les artères. Ces cellules se multiplient à partir d’un réseau vasculaire préexistant, s’infiltrent dans le microenvironnement tumoral et forment un nouveau réseau vasculaire. Cette angiogenèse initiée par la tumeur est très mal régulée comparativement à une angiogenèse physiologique : les nouveaux vaisseaux formés sont désorganisés et présentent une structure anormale. Ils sont dilatés, tortueux, hémorragiques et les connections entre vaisseaux sont anarchiques [35]. L’angiogenèse est essentielle au développement de la tumeur. Pour qu’une tumeur se développe et grossisse de manière significative, elle doit disposer d’un apport sanguin suffisant ; si la tumeur est incapable de se procurer l’apport sanguin dont elle a besoin, les cellules cancéreuses meurent, la croissance tumorale est arrêtée [36]. Les cellules endothéliales composant ces vaisseaux possèdent néanmoins des caractéristiques différentes des cellules vasculaires des tissus sains : leur prolifération, leur 14 migration et leurs interactions cellules-cellules ou cellules-MEC sont altérées [36]. En effet, elles surexpriment certaines protéines membranaires comme le récepteur du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) [37] mais également le VEGF lui-même, ce qui leur permet de proliférer abondamment. Les cellules endothéliales ont également une morphologie anormale et des jonctions intercellulaires lâches, ce qui augmente la taille des fenestrations  . Les péricytes qui assurent normalement l’intégrité des capillaires sont instables, voir absents. La membrane basale est également irrégulière, anormalement épaisse voir absente sur certaines portions de vaisseaux. L’hétérogénéité des facteurs pro-angiogéniques induits par la tumeur déstabilise l’équilibre qui contrôle normalement l’angiogenèse, induisant toutes ces aberrations.

 Les cellules immunitaires 

Un grand nombre d’études ont pu démontrer que la présence de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral, ainsi qu’un contact direct entre ces cellules et les cellules cancéreuses, permettent la destruction des cellules cancéreuses, la réduction de la tumeur et un meilleur pronostic. En effet, les cellules précancéreuses et cancéreuses peuvent être reconnues par le système immunitaire : ce phénomène s’appelle l’immuno-surveillance. Elles sont ensuite détruites (phase d’élimination) ou bien leur prolifération est contrôlée (phase d’équilibre). Néanmoins, l’efficacité du système immunitaire n’est pas complète, et les cellules cancéreuses qui ont acquis la capacité d’échapper au système immunitaire évoluent par la suite en tumeurs (phase d’échappement) [39]. En effet, les cellules tumorales peuvent perdre les molécules nécessaires à leur reconnaissance par le système immunitaire (mécanismes d’immuno-sélection) ; elles peuvent également modifier la réponse immunitaire (mécanismes d’immunosuppression active). Ces phénomènes d’immunosubversion se font en grande partie via l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. De plus, un nombre important d’études a montré que l’augmentation du nombre de cellules immunitaires qui infiltrent la tumeur est favorable à la progression et l’invasion tumorale [40]. Ces constatations contradictoires, montrant à la fois la présence de cellules immunitaires comme bénéfique ou néfaste au développement des tumeurs, n’ont pas encore trouvé d’explication complète [41]. Néanmoins il semble que les acteurs du système immunitaire, selon leur nature, peuvent endosser des rôles pro ou antitumoraux. La suite de cette partie ne prendra en compte que quelques exemples, ceux qui sont le plus décrits dans la littérature, et ne reflètera pas la complexité et la diversité des mécanismes mis en œuvre par le système immunitaire. 15 Macrophages : M1 et M2 ; Lymp.