Etude de la modulation de la réponse cellulaire au stress oxydatif par les protéines VP24 des virus Marburg et Ebola

LA PROTEINE VP24 DU VIRUS DE MARBURG ACTIVE LE FACTEUR NUCLEAIRE ERRα

Dans la première partie de ce travail, nous avons découvert que la protéine VP24 de MARV inhibait la régulation de Keap1 sur le facteur cellulaire Nrf2. Keap1 agit comme un adaptateur pour CUL3, une E3-ubiquitine ligase qui permet l’accrochage des chaînes d’ubiquitine au substrat qui doit être dégradé. Le ciblage de Keap1 par la VP24 induit l’activation de Nrf2, en d’autres termes la VP24 inactive Keap1 pour son activité inhibitrice de Nrf2. Nous nous sommes alors interrogés sur le devenir d’autres protéines cellulaires dont l’activité est modulée par Keap1, et en particulier sur les facteurs de transcription, afin d’évaluer le rôle de la VP24 dans la modulation du métabolisme cellulaire. Alors que nous identifiions l’interaction entre Keap1 et VP24, une équipe voisine de la nôtre, dirigée par Jean Marc Vanacker (IGFL de Lyon) démontrait que Keap1 était un inhibiteur d’un autre facteur de transcription cellulaire, le facteur ERRα (Estrogen Receptor-related Receptor alpha). Ce récepteur nucléaire orphelin appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires aux hormones et est impliqué dans la survie cellulaire [414], la division cellulaire [415]. En outre, une forte expression de ce facteur est considérée comme mauvais pronostic dans le développement de cancers et dans l’expansion tumorale [416]. Enfin, il semblerait que le facteur ERRα joue également un rôle important dans la migration cellulaire. Au point de vue moléculaire, la surexpression de Keap1 conduit à la diminution de l’activité d’ERRα dans un système de gène rapporteur. De plus, un autre adaptateur des substrats cellulaires à CUL3, la protéine SPOP (BTB Domain-containing Speckle-type POZ Protein) [417] a également été incriminé dans l’inhibition de l’activité de ERRα En raison de leur capacité à lier CUL3, Keap1 et SPOP pourraient être à l’origine de l’ubiquitination d’ERRα et de son adressage au protéasome. Par contre, une autre protéine se liant à CUL-3, la protéine KLHL12, n’inactive pas ERRα, qui reste actif au niveau transcriptionnel (voir Figure R14). Dans ce contexte, il était particulièrement intéressant pour nous d’étudier l’impact de la VP24 de MARV sur l’activité de ERRα. 99 Figure R14 : Implication des adaptateurs de CUL-3 dans la régulation de l’activité du facteur de transcription ERRα.En présence de Keap1 ou de SPOP, l’activité transcriptionnelle d’ERRα est inhibée. En raison des caractéristiques connues de ces protéines (adaptateurs pour l’ubiquitination et pour l’adressage au protéasome), nous supposons qu’ERRα serait envoyé vers le protéasome en présence de ces protéines. Par contre, un autre adaptateur de CUL3, KLHL12, n’inhibe pas ERRα, et n’induirait donc pas son adressage au protéasome. Nous avons tout d’abord quantifié l’activité de ERRα exprimé seul ou en combinaison avec différentes protéines cellulaires. Pour ce faire, nous avons utilisé un système de gène rapporteur Luciférase codé par le plasmide pGL3-ErrEtk-Luciférase. De façon similaire au système employé précédemment pour quantifier l’activité transcriptionnelle de Nrf2 (Figure R10), ce plasmide permet d’évaluer l’activité de ERRα, puisque l’expression de la Firefly-Luciférase est sous le contrôle de la séquence cible promotrice où se fixe ERRα (voir Figure R14). Ce système de gène rapporteur a été employé pour toutes les expériences réalisées de cette partie de notre travail. 100 Figure R14 : Principe de la mesure de l’activité du gène rapporteur exprimé par le pGL3-ERRE-TkLuc (Firefly), sous le contrôe du facteur de transcription ERRα. Dans un premier temps, nous avons souhaité confirmer l’activité de différentes protéines partenaires de CUL3 sur l’activité d’ERRα. Pour ce faire, des cellules Hela ont été transfectées par le plasmide pGL3-ErrEtk-Luciférase, le plasmide pRTKL, en présence d’ERRα-Flag (barres noires) ou de plasmide vide (barres blanches). Les protéines testées pour la modulation d’ERRα ont également été surexprimées, par transfection des plasmides pSPORT6-Keap1, pcDNA3-SPOP-HA ou pcDNA-KLHL12. 48h après transfection, les activités Firefly et Renilla Luciférase ont été déterminées, et la valeur de Firefly normalisée par la valeur Renilla (reflet du nombre de cellules transfectées). Ces valeurs ont ensuite été comparées à la valeur contrôle (sans expression d’ERRα ni de protéine modulatrice, fold :1). Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure R15. La surexpression d’ERRα active fortement l’activité du gène rapporteur, permettant d’atteindre un Fold de 8. SPOP et Keap1 diminuent l’activité d’ERRα, en conduisant à des Folds de 3 et 6,5, respectivement. L’inhibition Keap1-dépendante apparaît donc plus modérée que l’inhibition SPOP-dépendante. Par contre, l’expression de KLHL12 (Kelch-Like Protein 12), un autre adaptateur de CUL3 [418], n’induit pas d’inhibition de ERRα, et semble même activer le facteur, puisqu’on atteint un Fold de 14,5 (possiblement en induisant une saturation des E3 Ubiquitine Ligases). Ce résultat montre que le ciblage de ERRα par des adaptateurs de CUL3 est fortement spécifique de l’adaptateur employé, et confirme les résultats préalablement obtenus par nos collaborateurs. 101 Figure R15: Keap1 inhibe l’activité transcriptionnelle de ERRα. Des cellules Hela ont été transfectées par pGL3-ErrEtk-Luciférase, pRTKL, pHCMV vide (barres blanches) ou pSG5-ERRα-Flag (barres noires) et par les plasmides codants pour les protéines indiquées (pSPORT6- Keap1, pcDNA3-SPOP-HA, pcDNA-KLHL12). 48h après transfection, les valeurs de Firelfy (inducible) et de Renilla (constitutive) ont été mesurées. Les valeurs de Firefly Luciférase ont été normalisées par la valeur de Renilla puis comparées à la valeur du contrôle négatif non stimulé (transfection avec le plasmide vide). Les données représentent la moyenne des valeurs obtenues pour 3 expériences indépendantes, les barres d’erreur représentent l’écart-type. Dans ce contexte, nous avons alors voulu savoir si la VP24 exerçait une régulation sur l’activité transcriptionnelle d’ERRα. Pour ce faire, nous avons réalisé la meme expérience que précédemment, en utilisant les mêmes plasmides (pGL3-ErrEtk-Luciferase, pRTKL, pSG5-ERRα-Flag), et des concentrations croissantes de pHCMV-VP24. Nous constatons que plus la quantité de VP24 est élevée, plus l’activité de ERRα augmente. Donc, il semble que la VP24 soit capable d’induire l’activité transcriptionnelle de ERRα, et ceci de façon dose-dépendante (Figure R16). Figure R16: La protéine VP24 active le facteur ERRα. Des cellules Hela ont été transfectées par pGL3-ErrEtk-Luciférase, pRTKL, pHCMV vide (barres blanches) ou pSG5-ERRα-Flag (barres noires) et des concentrations croissantes de pHCMV-VP24. 48h après transfection, les valeurs de Firelfy (inducible) et de Renilla (constitutive) ont été mesurées. Les données de Firefly Luciférase ont été normalisées par la valeur de Renilla puis les données ont été comparées à la valeur du contrôle négatif non stimulé (transfection avec le plasmide vide). Les données représentent la moyenne des valeurs obtenues pour 3 expériences indépendantes, les barres d’erreur représentent l’écart-type. 102 Dans la mesure où la VP24 cible Keap1 et où Keap1 inhibe ERRα, nous avons supposé que l’activation d’ERRα en présence de VP24 était liée à Keap1. Afin de confirmer cette hypothèse, l’activité du gène rapporteur codé par le plasmide pGL3-ErrEtk-Luciférase a été mesurée en employant la stratégie expérimentale décrite précédemment. Ici, des cellules Hela ont été transfectées avec la combinaison pGL3-ErrEtk-Luciférase, pRTKL, en présence d’ERRα-Flag (barres noires) ou non (barres blanches) en présence de 2 concentrations différentes du plasmide pSPORT6-Keap1 (12,5 ou 25 ng par puit), ou de SPOP, à une concentration de 25ng par puit. Des quantités croissantes de VP24 de MARV ont également été transfectées. 48h après transfection, les mesures de Firefly et de Renilla Luciférase ont été mesurées et analysées comme précédemment pour calculer l’induction de l’expression du gène rapporteur (Figure R17). Figure R17: L’action de la VP24 sur ERRα ne change pas en fonction de la dose de Keap1 employée. Des cellules Hela ont été transfectées par pGL3-ErrEtk-Luciférase, pRTKL, pHCMV vide (barres blanches) ou pSG5-ERRα-Flag (barres noires) et des concentrations croissantes de pHCMV-VP24 (0, 5, 12.5, 25 et 50 ng) combinées deux concentrations différentes de pSPORT6-Keap1 (12,5 ou 25 ng), ou avec 25 ng de pcDNA3-SPOP-HA. 48h après transfection, les valeurs de Firelfy (inducible) et de Renilla (constitutive) ont été mesurées. Les valeurs de Firefly Luciférase ont été normalisées par la valeur de Renilla puis les données ont été comparées à la valeur du contrôle négatif non stimulé (transfection avec le plasmide vide). Les données représentent la moyenne des valeurs obtenues pour 3 expériences indépendantes, les barres d’erreur représentent l’écart-type. De façon surprenante, l’augmentation d’activité de ERRα par addition de VP24 était identique quelque soit la quantité de Keap1 présente. De plus, nous avons également testé l’effet de la VP24 sur l’activité d’ERRα en présence d’un autre inhibiteur, SPOP. De même que pour Keap1, la VP24 semble capable de supprimer l’effet inhibiteur de SPOP en restaurant l’activité d’ERRα, mais cet effet est plus modéré que celui observé lorsque Keap1 est surexprimé (Figure R17). Enfin, nous avons testé l’effet de la VP24 en présence de différentes molécules, inhibitrices de ERRα (Figure R18) : Keap1, SPOP, CUL3 ; ou non-inhibitrice : KLHL12. Des cellules Hela ont été transfectées avec les mêmes plasmides que précédemment : pGL3-ErrEtk-Luciferase, pRTKL, pSG5- ERRα-Flag, en présence de pHCMV-VP24 (barres noires) ou de plasmide vide (barres blanches), et 103 des plasmides codants pour des adaptateurs de CUL3 : Keap1, SPOP, KLHL12, ou de CUL3 elle-même. L’activité du gène rapporteur a été normalisée par l’activité de la Firefly-luciférase. Les valeurs ont été comparées à la valeur obtenue dans le contrôle (surexpression d’ERRα sans autre protéine).  LA PROTEINE VP24 DU VIRUS EBOLA EST UN INHIBITEUR DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION NRF2 La protéine VP24 d’ EBOV possède 36% d’homologie de séquence avec la protéine VP24 de MARV, et ces protéines sont parmi les plus conservées dans la famille des Filoviridae. En outre, elles possèdent des propriétés communes, telle que leur capacité à s’oligomériser et à s’associer aux membranes. Enfin, elles sont toutes les deux impliquées dans la condensation des nucléocapsides virales. Compte tenu de l’existence de fonctions communes pour ces protéines, il nous a donc semblé intéressant d’évaluer la voie de réponse au stress oxydatif cellulaire en présence de la VP24 d’EBOV, la première partie ce de travail ayant mis en évidence que Keap1 interagit avec la VP24 de MARV, résultant en une activation du facteur de transcription Nrf2. La protéine VP24 du virus Ebola inhibe l’activité de Nrf2 Nous avons tout d’abord tenté de voir si lors de l’infection par EBOV il existait une régulation de l’activité de Nrf2. Des cellules 293T ont été transfectées soit par un plasmide vide (empty), soit par le pHMCV-Nrf2, avant d’être infectées 3h plus tard par le virus EBOV recombinant (produit par génétique inverse) à une MOI de 3, ou laissées non-infectées. 1, 2 et 3 jours après infection, les cellules ont été lysées dans du tampon Laemmli et les lysats analysés par western blot pour l’expression de NQO1, VP24, Nrf2 et de l’Actine. Le signal obtenu pour le western blot anti-NQO1 a été quantifié à l’aide du Chemidoc XRS Imager (Biorad) puis normalisé par le signal obtenu pour l’actine sur la même membrane, et comparé à la valeur obtenue pour le contrôle négatif (puits non infecté, non transfecté à jour 1). Comme nous l’avons vu précédemment, la surexpression du facteur Nrf2 conduit à son activation, c’est pourquoi la quantité relative de NQO1 était augmentée (Figure R19A, comparer le graphe de gauche avec celui de droite). Ce système était donc judicieux pour évaluer l’effet d’EBOV sur l’activité de Nrf2. Dans tous les cas, l’expression de NQO1 était augmentée au cours du temps, mais dans les cellules infectées et transfectées par le plasmide vide, le taux d’NQO1 relatif était plus faible que dans les cellules non-infectées (Figure R19A, panel de gauche). Cet effet, bien que plus modéré, était toujours visible dans les cellules préalablement transfectées par Nrf2. Dans les deux cas, l’inhibition de la synthèse de NQO1 semble plus marquée le 3ème jour que le 2ème jour post-infection. La différence d’effet du virus EBOV entre les deux types de cellules (transfectées par Nrf2 ou par le plasmide vide) s’explique probablement par le fait que la surexpression de Nrf2 est très puissante en termes d’activation de sa fonction transcriptionnelle, et en parallèle le blocage de cette activité par EBOV nécessite plus de temps pour permettre la synthèse des protéines virales impliquées dans cette inhibition. Dans le but de confirmer l’effet inhibiteur d’EBOV sur le facteur Nrf2, nous avons développé une deuxième approche expérimentale, où des cellules Vero ont été infectées à une MOI de 3 pendant 24h avant d’être traitées par 10µM de tBHQ. tBHQ est une molécule libérant Nrf2 de Keap1 et favorisant sa stabilisation, ce qui conduit à son activation [419]. Les cellules ont été lysées 1, 2 et 3 jours après l’infection, et les lysats ont été analysés de même que précédemment. L’effet de tBHQ, s’il existe, était difficilement perceptible dans notre test, soit parce qu’une concentration trop faible a été utilisée, soit parce que l’activité de cette molécule n’est pas stable au cours du temps. Toutefois, l’effet d’EBOV sur la synthèse de NQO1 était visible, que les cellules soient traitées ou non. En effet, alors qu’il est difficile d’observer une différence d’induction de NQO1 entre les cellules infectées et non-infectées à jour 1 (Figure R19B, panel de gauche), à partir du 2ème jour d’infection le 105 taux relatif d’expression de NQO1 était clairement diminué dans les cellules infectées par rapport aux cellules non-infectées, ce qui confirme notre analyse précédente en 293T qui montrait une inhibition de l’activité de Nrf2 par EBOV, et ceci de façon dépendante du temps. De plus, de façon intéressante, l’inhibition EBOV-dépendante de la synthèse de NQO1 semble plus forte dans les cellules traitées avec tBHQ que dans les cellules non traitées (Figure R19B, comparer le panel « ZEBOV » de gauche infecté avec le panel « ZEBOV » de droite). Ces deux expériences montrent donc que contrairement à ce que nous avions mis en évidence lors d’une infection à MARV, l’infection de cellules par EBOV conduit à un blocage de l’expression de protéines sous le contrôle du facteur de transcription Nrf2. Le virus EBOV empêche donc l’activité transcriptionnelle de Nrf2.Etude du mécanisme moléculaire à l’origine de l’inhibition de Nrf2 par la VP24. Il est alors apparu important de comprendre le mécanisme moléculaire à l’origine de l’inhibition par la VP24 du facteur Nrf2. Dans la mesure où l’import nucléaire de la protéine Nrf2 est médié par la Karyophérine alpha 1 [362], et que cette protéine est un partenaire connu de la VP24 d’EBOV[95-97], nous nous sommes intéressés à la localisation intracellulaire de Nrf2 en présence de VP24. Pour ce faire, nous avons analysé la localisation cellulaire d’une protéine Nrf2 recombinante couplée à la GFP. Des cellules Vero ont été transfectées par le pEGFP-C2 dans lequel avait été cloné le gène de Nrf2, soit seul (Figure R21A), soit co-transfecté avec le plasmide codant pour la VP24 (Figure R21B). 16h après transfection, les cellules ont été privées de sérum pendant 1h avant d’être traitées avec 50µM de tBHQ ou avec une dilution de DMSO (1 :10000), contrôle de diluant. Le traitement a été poursuivi pendant 2h puis les cellules ont été analysées pour la localisation de Nrf2-GFP. Dans les cellules non traitées, Nrf2-GFP est distribuée de façon homogène à la fois au niveau nucléaire et cytoplasmique. Sous l’impact du traitement, Nrf2-GFP se relocalise strictement au niveau nucléaire (Figure R21A). Ce système permettait donc d’étudier le transport nucléo-cytoplasmique de Nrf2 et de mesurer l’impact de la VP24 sur ce transport. Lorsque Nrf2-GFP a été exprimé conjointement à la VP24, les cellules ont été traitées de la même façon, puis fixées avec une solution à 4% de PFA et perméabilisées par une solution de Triton X100. La VP24 a ensuite été marquée à l’aide de l’anticorps anti-VP24 et d’un anticorps secondaire anti-lapin Alexa 555 (rouge) selon le protocole d’immunofluorescence. La co-expression de Nrf2-GFP avec la VP24 d’EBOV induit une nouvelle distribution : en présence de VP24, Nrf2 semble s’accumuler dans le cytoplasme, au niveau de larges agrégats péri-nucléaires (Figure R21B, 1ère ligne). Un traitement par la solution de tBHQ ne permet pas de détruire ces agrégats et d’induire une relocalisation nucléaire de Nrf2 dans les cellules où la VP24 est présente (Figure R21B, flèche jaune). Toutefois, dans les cellules où l’expression de VP24 est plus faible, l’induction de la translocation nucléaire de Nrf2 est visible (flèches blanches). Il semble donc que le facteur Nrf2 soit ségrégé par la VP24 au niveau cytoplasmique. De plus, les agrégats péri-nucléaires où est relocalisée Nrf2-GFP contiennent aussi la protéine VP24, ce qui indique que le blocage de l’activité de Nrf2 par la VP24 semble lié à une colocalisation de ces deux protéines au niveau péri-nucléaire, et par conséquent à une inhibition de la translocation nucléaire de Nrf2.