Étude de la transmission du virus grippal dans les espaces clos : rôle des supports

EVALUATION DES VIRUS INFECTIEUX PAR VIRAL PLAQUE ASSAY

Le principe du test de Viral Plaque Assay repose sur l’observation des plages de lyse causées par des effets cytopathogènes suite à l’inoculation de virus sur un tapis cellulaire. Ce test se réalise en plaque 6 puits sur des cellules MDCK infectées par des dilutions en cascade de l’échantillon viral. La lecture des plaques de titration consiste à dénombrer les plages de lyses cellulaire obtenues après inoculation et incubation du virus sur les tapis cellulaires immobilisés par un milieu gélosé. Le nombre de plages de lyse est utilisé afin de déterminer la quantité de virus infectieux. 

Préparation des cellules MDCK

Pour réaliser les titrations VPA, un pool de cellules MDCK a été constitué pour éviter toutes dérives cellulaires. Un aliquote de cellules est remis en culture pour chaque titration. Les cellules sont cultivées en adhérence en flasques de 75 cm2 avec du milieu MEM modifié. Dès que le tapis a recouvert toute la surface disponible, les cellules arrêtent leur multiplication, se décollent et meurent. Il faut donc traiter le tapis avant ce stade de manière à obtenir une suspension cellulaire capable de « repartir » dans un milieu neuf. Pour cela, des lavages au tampon PBS (Sigma, P4417) sont réalisés afin d’éliminer les cellules mortes et les traces de sérum. Les cellules sont par la suite décollées sous l’action de trypsine-EDTA à 0,25% (Sigma, T4049). L’étape de trypsination permet de décoller les cellules adhérentes à la flasques (enzyme protéolytique) détruit certaines protéines de liaison et brise ainsi les liens entre les cellules, sans les altérer. Pour finir, les cellules sont dénombrées, 106 cellules sont remises en culture dans du milieu neuf. Les cellules vont sédimenter, se fixer sur le fond du flacon et se multiplier jusqu’à former à nouveau un tapis de cellules confluentes en 48h-72h. Les cellules sont réensemencées 3 fois avant d’être utilisées pour une titration. Le protocole mis en place dans le cadre de cette étude est adapté des travaux de Lindsley et al en 2010. La veille de la titration les cellules MDCK sont réensemencées en plaque six puits (Corning, T3516) à raison de 2 mL par puits d’une suspension à 106 cellules/mL en milieu MEM modifié. Les plaques sont ensuite incubées à 35°C avec 5% de CO2 le temps de former un tapis cellulaire confluent. Le jour de l’inoculation les cellules sont rincées avec du tampon PBS. 

Infection du tapis cellulaire

L’échantillon viral est dilué en milieu DMEM F12 compété avec du sérum d’albumine bovine à 35%. Le virus est dilué par des dilutions successives de raison 10. A partir des dilutions virales (10-2 à 10-7 ), 1000 µL sont respectivement déposées sur les tapis cellulaire des 6 puits de la plaque de titration. Après 45 min de contact à 35°C+5% de CO2 et avec une agitation toutes les 20 min, les inocula sont directement lavés avec 2 mL de tampon PBS puis retirés. 65 Un milieu gélosé composé d’agarose à 2%, de milieu de culture, de trypsine TPCK et de dextran à 1% est ensuite coulé sur le tapis cellulaire infecté. La plaque de titration est ensuite incubée à 35°C +5 % de CO2 pendant 48-72h. II.3.C Révélation et lecture de la plaque Les tapis cellulaire de la plaque de titration sont fixés en ajoutant directement sur les géloses 2 mL de formaldéhyde à 9%. Après 30 min, les géloses sont retirées précautionneusement à l’aide d’un scalpel. Les tapis sont ensuite colorés à l’aide d’une solution de cristal violet. Après 15 min de coloration, les tapis sont lavés avec de l’eau distillée puis séchés. Le dénombrement est réalisé en priorité sur les puits dont le nombre de plages est compris entre 30 et 100. Le titre infectieux est déterminé grâce à la formule suivante : Les résultats d’une quantification par VPA sont exprimés en Plaque Forming Unit (PFU)/mL. La limite de quantification est de 30 PFU/mL. 

DISPOSITIF D’AEROBIOCONTAMINATION VIRALE

Un outil laboratoire d’aérobiocontamination (Figure 34) a été élaboré afin d’étudier le rôle des supports sur la persistance du virus Influenza. L’objet de ce banc expérimental est d’obtenir une contamination maîtrisée et reproductible par un aérosol viral stable et viable dans un environnement sécurisé. Figure 34 Représentation schématique et photographie du dispositif expérimental (1) Nébuliseur Collison, (2) Colonne de séchage, (3) Chambre d’homogénéisation, (4) Electrical Low Pressure Impactor (ELPI), (5) Bio-collecteur SKC, (6) Impacteur Andersen Il est composé d’une chaîne de production de l’aérosol, d’un volume de conditionnement avec une hygrométrie et une température contrôlées, associé à une métrologie spécifique (Chapitre II : 1.3) permettant de caractériser la taille et la concentration des aérosols produits. 3 TH 1 2 M Qairsec Pnébuliseur 4 QELPI 5 QSKC 6 Qimpacteur Pompe Filtre HEPA Débitmètre M Manomètre Vanne 3 voies Vanne 2 voies TH Thermo hygromètre 

STABILITE DE L’AEROSOL

De manière à vérifier les constantes physiques du banc expérimental nous avons vérifié la stabilité de la production en aérosol. Pour ce faire, nous avons mesuré à l’aide de l’ELPI sur une tranche granulométrique de 0,04 et 5 µm la concentration particulaire au cours du temps. Cette dernière se stabilise rapidement en 2 min de nébulisation. La stabilité de la concentration est maintenue pendant 10 min avec une dispersion évaluée à ± 3% (Figure 35). Figure 35 Evolution de la concentration particulaire de 0,21 à 0,81 µm à partir d’une suspension virale en substitut salivaire (HR 30%, 20°C, suspension à 3×109 unités génomiques/mL). Au bout de 10 minutes la concentration particulaire commence à augmenter. Ce phénomène est attribué à l’accroissement de la concentration de la suspension de génération durant le fonctionnement du système (Baron et Willeke, 1993). La Figure 36 correspond au suivi du profil granulométrique moyen pendant 1 min de l’aérosol. Au cours de ces 10 minutes, la granulométrie évolue seulement pour les particules très fines inférieures à 0,06 µm. L’accroissement observé pour les particules fines est lié à l’augmentation de la concentration en sels. Figure 36 Evolution au cours du temps de la granulométrie de l’aérosol de 0,04 à 5 µm 

TAILLE DES PARTICULES VIRALES AEROSOLISEES

L’étude de la granulométrie de l’aérosol produit à partir de la suspension virale en substitut salivaire est réalisée après 2 minutes de stabilisation de la concentration et sur une concentration moyenne mesurée pendant 5 minutes. La distribution granulométrique en nombre (Figure 37) est obtenue grâce à l’impacteur l’ELPI. Afin de discerner l’impact de la composition du milieu d’atomisation sur le profil granulométrique de l’agent biologique, un témoin « suspension » sans virus a également été atomisée. L’aérosol produit à partir de la suspension virale est composé de particules comprises entre 0,04 et 9 µm. L’analyse de ce profil moyenné sur une durée de 5 minutes d’atomisation, montre une distribution polydispersée (σg= 1,6) avec un mode à 0,08 µm Figure 37). Un profil identique, non tributaire de la présence des virions, mais reflétant la composition en sels du milieu de génération est obtenu avec le témoin « suspension ». Ainsi, le profil granulométrique des virions est masqué par la composition en sels du milieu d’atomisation, résultat également observé dans les travaux de (Fabian et al., 2009). Figure 37 Profil granulométrique moyen de l’aérosol (HR 30%, 20°C, suspension à 3×109 unités génomiques/mL)- ELPI (DEKATI Ltd). En considérant une particule sphérique, non poreuse et d’une masse volumique égale à 1g/cm3 , nous avons étudié la répartition en volume de l’aérosol. La distribution montre un profil compétemment différent . En effet, nous pouvons observer un mode à 0,8 µm (Figure 38). 69 Figure 38 Distribution en nombre et en volume de l’aérosol Afin de compléter cette mesure physique et accéder à la taille des particules contenant des virus, nous avons déployé une méthode moléculaire (PCRq) associée à la mesure du titre infectieux (VPA). Pour ce faire, les particules virales sont recueillies pendant 5 minutes sur les étages de l’ELPI recouverts d’un support en polycarbonate enduit de glycérol. Nous avons au préalable testé la répétabilité des méthodes analytiques employées. Ainsi, la dispersion des mesures (Figure 39), évaluée à partir des extractions et analyses en PCRq et VPA répétées d’un même inoculum viral, a été estimée à 17% pour le virus Influenza (n=6). Cette répétabilité apparaît suffisante pour analyser la granulométrie et le devenir sur les supports des aérosols de virus. Figure 39 Estimation de la dispersion de l’analyse par PCR (Extraction d’ARN et analyse RT-PCRq) – A et du titre infectieux – B. Concernant la taille des virus en aérosol produit dans le banc expérimental, nous avons représenté leur granulométrie dans la Figure 40 et la Figure 41. Ainsi, le mode centré à 0,08 µm du aux sels n’est plus observé. La répartition granulométrique des particules infectieuses est similaire à la mesure des unités génomiques obtenue par PCRq. Les particules virales sont comprises dans une gamme de tailles comprises entre 0,04 et 5 µm, avec une répartition bimodale (modes à 0,25 et 0,75 µm).