MATERIELS ET METHODES

Etudes phytochimiques

Préparation de l’extrait à tester

Clidemia hirtaa été collectée le mois d’avril 2002 dans la région de Moramanga, Côte Est de Madagascar.
Après séchage à l’ombre, les tiges feuillées de Clidemia hirtaont été broyées et réduites en poudre. Deux cent grammes de cette poudre ont été macérés dans 2 litres d’un mélange éthanol-eau (80 : 20) pendant 72 heures à la température ambiante de laboratoire.
Après filtration, le résidu a été repris avec lemême volume du même mélange de solvants pendant 72 heures. Puis après filtration, les deux filtrats ont été mélangés et évaporés à sec sous vide à 70°C à l’aide de ROTAVAPOR (BÜCHI type W 240) pour obtenir l’extrait hydroalcoolique (EHA) à tester.
Des tests in vivo chez la souris et le rat ont été effectués avec cet EHA pour déterminer l’activité pharmacologique de Clidemia hirta. Les différentes phases de préparation de l’EHA sont résumées sur le Schema1 ci-après.

Criblage phytochimique

Pour déterminer qualitativement les différentes familles chimiques contenues dans l’extrait hydroalcoolique de Clidemia hirta, un criblage phytochimique a été effectué selon les méthodes de  FONG (1977). Il est basé sur la formation de complexes insolubles (réaction de précipitation) ou sur la formation de complexes colorés (réaction de coloration), en utilisant des différents réactifs chimiques spécifiques pour chaque famille (Tableau II). Pour quantifier les familles chimiques, leur absence (-) ou leur présence à l’état de trace (+) ou à moyenne concentration (++) ou à forte concentration (+++) ont été notées.

Tests pharmacologiques

Animal d’expérience

Pour toutes les expériences, des souris de souche SWISS, de sexe mâle ou femelle, pesant en moyenne 30 grammes et des ratsde souche WISTAR de sexe mâle ou femelle, pesant entre 200 à 250 grammes provenant de l’élevage de l’Animalerie du Laboratoire de Pharmacodynamie, Département de Physiologie Animale et de Pharmacologie, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo, ont été utilisés.
Les animaux ont été mis à jeun 24 heures avant chaque expérience mais ont eu accès libre à l’eau.

Etude de l’activité antiulcéreuse de l’EHA de Clidemia hirta

Ulcère de stress

Le but de cette expérience sera d’évaluer l’activité antiulcéreuse de l’EHA sur des animaux soumis à un stress.

Ulcère de stress provoqué par la nage chez la souris

Sept lots de 6 souris ont été utilisés. Le lot témoin a reçu de l’eau distillée par voie orale. Un autre lot a reçu de la Cimétidine (TAGAMET ® ) à 100mg/kg par la même voie. Les 5 derniers lots d’animaux traités ont reçu chacun une dose de l’EHA à 10, 20, 40, 50 et 100mg/kg.
Trente minutes après l’administration des produits, les animaux ont été mis dans un bain dont la température de l’eau a été maintenue entre 20 et 25°C (PARMAR et DESAI, 1993 ; GROVER et coll. ; 2001).
Trois heures après, les animaux ont été sacrifiés et leur estomac a été prélevé et ouvert le long de la grande courbure.
Les points hémorragiques provoqués par la contrainte (stress) ont été comptés.
Les résultats ont été exprimés par la moyenned’indice d’ulcère calculée en divisant le nombre total des points hémorragiques par le nombre d’animaux dans chaque lot (GROVER et coll. ; 2001). Cette moyenne d’indice d’ulcère a été ensuite exprimée en pourcentage d’inhibition des points hémorragiques chez les animaux traités par rapport aux animaux témoins.

Ulcère de stress par extension des 4 membres chez le rat

Les animaux ont été soumis à une diète totale de 24 heures la veille avant le début de l’expérience pour la commodité des examens de l’estomac. Ils ont été ensuite répartis en 5 lots de 6 rats. Le lot témoin a reçu de l’eau distillée.
Un autre lot a reçu 100mg/kg de Cimétidine (TAGAMET ® ) utilisée comme produit de référence.
Les 3 lots restants ont reçu l’EHA à des différentes doses : 50, 75 et 100mg/kg. Les produits ont été administrés par voie orale et le volume administré a été fixé à 1ml par 100 grammes de poids corporel Immédiatement après l’administration des produits, chaque animal a été fixé en position décubitus dorsal par extension des 4 pattes sur une plaque en treillis métallique horizontal (GAIRARD et coll. ; 1967).
Dix huit heures après, les animaux ont été sacrifiés. Leur estomac a été prélevé, ouvert suivant la grande courbure, rincé et étalé pour compter les ulcères au niveau de la muqueuse stomacale.
L’activité antiulcéreuse de l’EHA a été exprimée en indice d’ulcère selon les calculs suivants :

Ulcère provoqué par des agents ulcérogènes

L’objectif de cette expérience sera de mettre en évidence et d’évaluer l’activité antiulcéreuse de l’EHA en provoquant des ulcères au niveau de la muqueuse stomacale par des agents ulcérogènes. Ulcère provoqué par le mélange acide chlorhydrique – éthanol (0.3M / 60%) chez la souris. L’administration du mélange HCl / éthanol par voie orale entraîne l’apparition d’un ulcère aigu (HIRUMA-LIMA, 2000).
Six lots de 6 souris ont été utilisés dont un lot témoin qui a reçu de l’eau distillée.
Chaque lot traité a reçu une dose de l’EHA allant de 75, 100, 150 à 200 mg/kg.
Un autre lot a reçu 20mg/kg de Pantoprazole (EUPANTOL ® ) utilisée comme produit de référence.
Cinquante minutes après l’administration des produits, tous les animaux ont reçu 0.2ml du mélange HCl / éthanol (MIZUI et DOTEUCHI, 1983 ; SUN et coll., 1991 ; YESILADA et coll., 1997 ; SUFFREDINI, 1999 ; HIRUMA-LIMA et coll., 2000). Une heure après l’administration du mélange, les animaux ont été sacrifiés. Leur estomac a été prélevé, ouvert le long de la grandecourbure, rincé et étalé pour faciliter la mesure de l’hyperhémie gastrique.
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne de la longueur des hyperhémies en divisant leur longueur totale au niveau de la muqueuse stomacale par le nombre d’animaux de chaque lot. La moyenne a été ensuite utilisée pour calculer le pourcentage d’inhibition des hyperhémies observées chez les animaux traités par rapport au lot témoin.

Ulcère provoqué par l’éthanol 95% chez le rat

L’éthanol 95% a été choisi comme agent agressif chez le rat (ROBERT et NEZAMIS, 1979 ; HOLLANDER et coll., 1985 ; MORIMOTO et coll., 1991 ; SAIRAM et coll., 2002). Cinq lots de 6 rats ont été utilisés. Le lot témoin n’a reçu que de l’eau distillée et un autre lot a reçu 20mg/kg de Lanzoprazole (LANZOR ® ) utilisé comme produit de référence. Les 3 autres lots ont reçu l’EHA à 3 doses différentes de 100, 150 et 200mg/kg. Une heure après l’administration des produits, les animaux ont reçu 1ml d’éthanol (95%) par voie orale (SAIRAM et coll., 2002).
Une heure après l’administration de l’éthanol, les animaux ont été sacrifiés puis leur estomac a été prélevé, ouvert le long de la grande courbure, étalé pour faciliter la mesure de l’hyperhémie provoquée par l’alcool.
Les résultats ont été exprimés par la moyenne de la longueur des hyperhémies et aussi par le pourcentage d’inhibition des hyperhémies chez les animaux traités par rapport aux animaux témoins.

Etude de la toxicité aiguë de l’EHA

Pour étudier les signes d’intoxication ainsi que le taux de mortalité, 7 lots de 6 souris ont été mis à jeun 12 heures avant l’expérience (SOUZA BRITO et coll., 1998).
Les animaux du lot témoin ont reçu de l’eau distillée et les autres lots ont reçu une seule administration d’EHA de Clidemia hirtaaux doses respectives de 100mg/kg ; 1, 1.5, 2, 2.5 et 3g/kg à raison de 0.5ml par souris de 20 grammes.
La toxicité a été observée aux temps 5, 15, 30 minutes et à 1, 2, 4, 6 heures après l’administration de l’extrait. Pendant ces 6 premières heures d’observation, les animaux n’ont pas reçu d’aliment mais ont eu accès libre à l’eau. Ils ont été ensuite observés une fois par jour jusqu’au 14 e jour ; pendant cette période, ils ont été nourris à volonté avec la provende TIKO FEED-MELL 221 et de l’eau.

Etude de la tolérance gastrique

Afin d’observer d’éventuels effets toxiques sur la muqueuse gastrique suite à une administration quotidienne de l’EHA, 2 lots de 6 souris ont été utilisés. Le lot témoin a reçu de l’eau distillée tandis que le lot traité a reçu l’EHA à 15mg/kg ; cette dose correspond à la DE50 de l’EHA de Clidemia hirtachez la souris pour l’ulcère provoqué par le stress.
Les animaux ont reçu quotidiennement pendant 7 jours de l’eau distillée ou de l’EHA à 9 heures du matin. Durant cette période, ils ont été nourris avec la provende TIKO FEED-MELL 221 et ont reçu de l’eau à volonté. Au terme du traitement, les animaux ont été sacrifiés ; leur estomac a été prélevé, ouvert et la muqueuse gastrique examinée.
L’indice d’ulcère a été mesuré, selon la méthode de DOLLARD et coll. (1989), chez le lot traité comparativement au lot témoin.

Tests pharmacologiques

Effet de l’EHA sur l’ulcère de stress

La contrainte soumise aux animaux provoque au niveau de leur muqueuse stomacale une ulcération souvent accompagnée de rougeur qui se présente sous forme d’érosions punctiformes hémorragiques chez la souris (Photographie 2). L’estomac du rat soumis à un stress (extension des 4 pattes) présente des ulcérations hémorragiques trouant la muqueuse gastrique allant d’une érosion punctiforme à une érosion plus de 3mm (Photographie 4). L’administration de l’EHA de Clidemia hirtaréduit ces lésions gastriques se manifestant par une diminution de la coloration noire chez les animaux traités par rapport aux animaux témoins (Photographies 3 et 5).

Effet de l’EHA sur l’ulcère provoqué par des agents ulcérogènes

L’administration d’un agent ulcérogène chez les animaux provoque au niveau de la muqueuse gastrique une hyperhémie longitudinale visible par transparence à l’extérieur de l’estomac sous forme de lignes rouges ou noires. Elle se manifeste à l’intérieur de l’estomac par des longues et épaisses bandes rouges ou noires de longueur et de largeur variables et se trouve surtout dans le corps de l’estomac (Photographies 6 et 8). Cette hyperhémie se caractérise par un oedème de la sous muqueuse, une congestion intense de la muqueuse avec des vasodilatations capillaires intenses.
L’observation de la muqueuse gastrique de la souris et du rat traités montre une diminution de la longueur des hyperhémies par rapport aux animaux témoins (Photographies 7 et 9).

Absence d’émission de selles

Le premier signe observé chez 100% des animaux traités avec l’EHA de Clidemia hirtaaux doses allant de 1 ; 1.5 ; 2 ; 2.5 à 3g/kg est l’absence d’émission de selles. Ce signe apparaît 5 minutes après l’administration de l’EHA et disparaît au bout de 55 minutes.

Ataxie

Une diminution de la mobilité ou ataxie est aussi observée chez 100% des animaux traités avec l’EHA aux doses allant de 1 ; 1.5 ; 2 ; 2.5 et 3g/kg Elle apparaît 30 minutes après l’administration de l’EHA de Clidemia hirtaet les animaux retrouvent leur état normal 90 minutes après la manifestation de ce signe.

Polypnée

La polypnée est le troisième signe observée au cours du test de toxicité. Elle est enregistrée chez 33% des animaux traités à l’EHA de Clidemia hirtaà 3g/kg. Cette manifestation apparaît 5 minutes après l’administration de l’EHA et dure 10 minutes.

DISCUSSION

Les résultats des tests effectués chez la souriset le rat sur l’ulcère de stress montrent que l’EHA de Clidemia hirtapossède une activité antiulcéreuse traduite par la diminution de l’indice d’ulcère.
La stimulation nerveuse vagale due à un stress provoque la libération d’histamine qui se fixe aux récepteurs histaminiques de type 2 de la cellule pariétale de la muqueuse gastrique et provoque la sécrétion acide considérée comme le principal facteur génésiaque de l’ulcère de stress (KOO et coll., 1986 ; GOA et MONK, 1987 ; GLAVIN et SZABO, 1992 ; GROVER et coll., 2001).
Selon RICHARDSON (1990), le stress entraîne une anomalie de la sécrétion acide et le dicton « pas d’acide, pas d’ulcère » reste valable.
Le rôle de la sécrétion acide dans l’ulcère gastrique est illustré par l’efficacité des médicaments antisécrétoires dans cette indication. En effet, les antagonistes H2ou antiH2inhibent cette sécrétion gastrique acide et la principale conséquence est la réduction de l’acide gastrique qu’elle soit basale, diurne et nocturne ou stimulée par les repas (FONTAINE, 1984 ; ALLAIN, 2002). L’efficacité des antiH2 dans le traitement d’attaque ou de la maladie ulcéreuse par leur effet antisécrétoire est importante sur la sécrétion acide d’origine vagale (FONTAINE, 1984).
La Cimétidine (TAGAMET ® ), un antiH2, inhibe la sécrétion acide stimulée par l’histamine, les agonistes H2, la gastrine et les agonistes muscariniques (GOODMAN et coll.,1991).
Ainsi, le ou les principe(s) actif(s) de Clidemia hirtapourrai(en)t inhiber la sécrétion acide entraînant une diminution de l’indice d’ulcère chez la souris et le rat.
La sécrétion de mucus ainsi que de bicarbonates diminue après un stress (KOO et coll., 1986).
La diminution de la résistance de la muqueuse suite à un défaut ou à une déficience d’un ou de plusieurs mécanismes de défense de la muqueuse gastrique augmente la probabilité de survenue d’une ulcération (DELCHIER, 1984).
Le mucus constitue la première ligne de défense de la muqueuse gastrique en formant une couche protectrice sous forme de gel. Ce gel est résistant envers un certain nombre d’agents ulcérogènes tels que l’acide, les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), l’éthanol (WILLIAMS et TURNBERG, 1980 ; BELL et coll., 1985 ; KOO et coll., 1986 ; ALLEN et coll., 1993 ; TERRANO et coll., 1993). Cependant, la sécrétion de bicarbonates est stimulée par l’acidification luminale (HOLZER, 2000).
Les bicarbonates contribuent à laneutralisation des ions H + retro diffusants vers la cellule épithéliale (ALLEN et coll., 1993 ; LICHTENBERG, 1999).
L’inhibition de l’ulcère de stress pourrait être produite par l’action du ou des principe(s) actif(s) de Clidemia hirtasur les facteurs de défense de la muqueuse gastrique en augmentant la production de mucus et la sécrétion de bicarbonates.
Les résultats du criblage phytochimique montrent que l’EHA de Clidemia hirta renferment des tanins.
Le stress altère le métabolisme de la muqueuse gastrique. L’ulcère de stress est dû à une augmentation des radicaux libres générés par le facteur acido-pepsique qui provoque une ulcération oxydative de la muqueuse gastrique (MILLER, 1987 ; SAIRAM et coll., 2002).JOSE et KUTTAN (1995), GHOSAL et coll. (1996), SAIRAM et coll. (2002) ont effectué des études sur l’activité antioxydante des plantes. BHATTACHARYA et coll. (2000) ont rapporté l’activité antioxydante in vivo des extraits tanniques.
Ainsi, l’EHA de Clidemia hirtapourrait exercer une activité antioxydante grâce à ses constituants tanniques.
Concernant l’ulcère expérimental provoqué par l’administration du mélange HCl / éthanol chez la souris et de l’éthanol chez le rat, les résultats montrent une activité protectrice exercée par l’EHA de Clidemia hirtaenvers l’effet nocif de ces agents en diminuant la longueur des hyperhémies gastriques. L’administration de l’éthanol entraîne la formation d’un ulcère aigu et la présence de l’acide chlorhydrique accélère le processus (MIZUI et coll., 1983 ; SUN et coll., 1991).
L’éthanol provoque une solubilisation et une déplétion de mucus qui sont les seuls mécanismes pathogéniques responsables des lésions gastriques induites par l’éthanol (KOO et coll., 1986 ; SALIM, 1990 ; MARHUENDA, 1993 ; HIRUMA-LIMA et coll., 2000).
Les ulcères gastriques provoqués par l’éthanol ne sont pas inhibés par des antisécrétoires tels que la Cimétidine mais par des agents qui augmentent les facteurs protecteurs de la muqueuse gastrique tels que le Misoprostol et les prostaglandines E2 (ROBERT et coll., 1979).
En effet, les médicaments protégeant la muqueuse gastrique libèrent des produits insolubles recouvrant la muqueuse et la protègent ainsi contre les agents nécrosants. Ils peuvent également stimuler la sécrétion de mucus et entraînent la libération des prostaglandines (REID et coll., 1992). Ces prostaglandines endogènes (PGE2) inhibent la sécrétion acide, stimulent la production de mucus et de bicarbonates, augmentent le flux sanguin de la muqueuse gastrique (SERTIE et coll., 1988 ; GOODMAN et coll., 1991 ; HUI et coll., 1991 ; HOGABOAM et coll., 1993) ainsi que la résistance de la muqueuse gastrique envers les agents ulcérogènes (LEWIS et HANSON, 1991).
TAKEUCHI et coll. (1999) ont démontré la capacité de ces prostaglandines à stimuler la sécrétion de bicarbonates chez la souris et le rat.
Le Lanzoprazole (LANZOR ® ), en plus de son inhibition de la pompe H + -K + -ATPase, renforce la couche de mucus par l’intermédiaire des prostaglandines (BLANDIZZI et coll., 1999).
Clidemia hirtapourrait agir de la même manière, soit en libérant des produits insolubles tapissant ainsi la muqueuse gastrique soit en stimulant la synthèse de prostaglandines.
Les résultats obtenus lors du criblage phytochimique de l’EHA de Clidemia hirtarévèlent la présence de tanins et de saponines. GERMANO et coll.(1998) ont démontré que ces familles chimiques possédaient une activité antiulcéreuse.
En effet, les tanins sont capables de tapisser la muqueuse gastrique et la rendent plus résistante et moins perméable aux agressions chimiques (ASUZU et ONU, 1990).
D’une part, les résultats des tests sur l’ulcère de stress confirment l’hypothèse que l’EHA de Clidemia hirtapourrait inhiber la sécrétion acide. D’autre part, les résultats obtenus lors des tests sur l’ulcère provoqué par des agents ulcérogènes confortent l’hypothèse que l’EHA de Clidemia hirtapourrait exercer une activité gastroprotectrice en stimulant la synthèse des prostaglandines ou en mimant l’activité de celles- ciaugmentant ainsi la synthèse de mucus et la sécrétion de bicarbonates.
La comparaison du pourcentage d’inhibition de l’ulcère de stress chez la souris et le rat montre que l’EHA de Clidemia hirtapossède une activité antiulcéreuse sur les 2 modèles utilisés mais il est plus actif chez la souris. Cette différence observée pourrait être expliquée par la sensibilité de la souris à l’EHA de Clidemia hirtapar rapport au rat mais les 2 modèles animaux sont tous les 2 valables pour évaluer une activité antiulcéreuse d’extraits de plante.
En comparant les doses actives maximales de l’EHA de Clidemia hirtasur l’ulcère de stress et l’ulcère provoqué par des agents nocifs pour la muqueuse gastrique, l’EHA de Clidemia hirtaest plus actif pour inhiber l’ulcère de stress que l’ulcère provoqué par des agents ulcérogènes. Ce résultat pourrait s’expliquer par le fait que les constituants chimiques de l’EHA de Clidemia hirta agiraient comme antisécrétoire plutôt que mucoprotécteur.
L’absence d’émission de selles pourrait être attribuée aux tanins qui exercent un effet astringent et diminuent ainsi le péristaltisme intestinal (SUFFREDINI et coll., 1999) ; ce qui explique l’effet antidiarrhéique des tanins démontré par BRUNNETON (1993).

CONCLUSION

Les résultats des tests pharmacologiques démontrent que l’EHA de Clidemia hirta est capable d’inhiber la sécrétion gastrique acide et de protéger également la muqueuse gastrique contre des agents ulcérogènes.
La comparaison des résultats obtenus sur les 2 modèles d’ulcère expérimentés permet d’affirmer que l’EHA de Clidemia hirtaest plus actif à inhiber l’ulcère de stress que l’ulcère provoqué par des agents ulcérogènes.
De plus, les résultats de cette étude montrent aussi que le modèle d’ulcère provoqué chez la souris peut être utilisé pour évaluer l’activité antiulcéreuse d’extraits de plante.
L’ensemble des résultats pharmacologiques obtenus dans le cadre de cette étude justifie et confirme l’utilisation de Clidemia hirtapour traiter l’ulcère gastrique en Médecine traditionnelle.
Etant donné que l’extrait n’était pas purifié, il est difficile de définir le ou (les) principe(s) actif(s) et son (leur) mécanisme d’action. Des travaux ultérieurs seront axés sur l’isolement, la purification et la détermination du (ou des) principe(s) actif(s) de Clidemia hirtaainsi que son (leur) mécanisme d’action.

Table des matières

LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
LISTE DES PHOTOGRAPHIES ET SCHEMA
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
A- ETUDES PHYTOCHIMIQUES
I- Préparation del’extrait à tester
II- Criblage phytochimique
B- TESTS PHARMACOLOGIQUES 
I- Animal d’expérience
II- Etude de l’activité antiulcéreuse de l’EHA de Clidemia hirta
1-Ulcère de stress
1-1- Ulcère de stress provoqué par la nage chez la souris
1-2- Ulcère de stress par extension des 4 pattes chez le rat
2- Ulcère provoqué par des agents ulcérogènes
2-1- Ulcère provoqué par le mélange HCl / éthanol (0.3M / 60%) chez la souris
2-2- Ulcère provoqué par l’éthanol (95%) chez le rat
III- Etude de la toxicité aiguë de l’EHA de Clidemia hirta
IV- Etude de la tolérance gastrique
C- ANALYSE DES RESULTATS
RESULTATS
A- PHYTOCHIMIE
B- TESTS PHARMACOLOGIQUES
I- Effet de l’EHA sur l’ulcère de stress
1- Chez la souris
2- Chez le rat
3- Comparaison de l’effet de l’EHA de Clidemia hirtasur les 2 modèles d’ulcère de stress
II- Effet de l’EHA sur l’ulcère provoqué par des agents ulcérogènes
1- Chez la souris
2- Chez le rat
3- Comparaison de l’effet de l’EHA de Clidemia hirtasur les
2 modèles d’ulcère provoqué par un agent ulcérogène
III- Toxicité aiguë
IV- Conséquence sur la muqueuse gastrique du traitement semi-chronique avec l’EHA Clidemia hirta
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES