Étude du rôle de l’inflammasome et de la kinase Styk1 dans la régulation des lymphocytes cytotoxiques

Étude du rôle de l’inflammasome et de la kinase

Styk1 dans la régulation des lymphocytes cytotoxiques. Lors de la reconnaissance d’une cellule cible, les lymphocytes cytotoxiques T CD8 et Natural Killer (NK) opèrent un relargage polarisé de vésicules cytotoxiques contenant des molécules effectrices, notamment la perforine (PRF1) et le granzyme B. Le dysfonctionnement de l’exocytose des granules cytotoxiques est responsable d’une susceptibilité accrue aux pathogènes intracellulaires qui s’accompagne de l’activation continue et anarchique des lymphocytes cytotoxiques et des macrophages. Ce phénomène conduit à la lymphohistiocytose hémophagocytique (HLH), un syndrome auto-inflammatoire fatal en absence d’intervention thérapeutique. Les mutations des gènes codant pour la perforine (PRF-1) ou pour certaines des protéines impliquées dans la biogénèse ou le transport vésiculaire des granules cytotoxiques sont causales des formes familiales ou primaires de la HLH (FHL). La HLH fait également partie des complications secondaires aux infections à herpesviridae et à certains désordres immunologiques importants. En effet, on retrouve celle-ci chez les patients souffrant d’arthrite juvénile idiopathique (SoJIA). Dans ce contexte, l’étiologie demeure toutefois incomprise. Au moment d’entreprendre les travaux présentés dans ce manuscrit, le premier cas de HLH induite par une mutation menant à l’activation constitutive de la composante NLRC4 de l’inflammasome était décrit. L’inflammasome est une structure multimérique composée d’un récepteur cytosolique, de la protéine échafaud ASC et de la Caspase-1. On le retrouve notamment chez les macrophages et cellules dendritiques, permettant ainsi la reconnaissance de signaux pathogéniques (PAMP) ou de danger (DAMP). L’activation de l’inflammasome mène à la maturation des pro-formes de l’IL-1β et l’IL-18 ainsi qu’à leur sécrétion. L’activation constitutive de NLRC4 étant suffisante au déclenchement de la HLH, nous avons tenté de comprendre si cette structure y était essentielle dans le cadre des défauts génétiques de cytotoxicité. Avec pour objectif de répondre à cette question, nous avons invalidé l’inflammasome en abrogeant la protéine ASC ou Caspase-1 dans le modèle murin de HLH déficient pour la perforine (PRF1 – /-). Nous avons également testé l’hypothèse qu’un déficit de cytotoxicité pouvait expliquer le développement de la HLH chez les patients souffrant de SoJIA. Nos résultats montrent que l’inflammasome est nécessaire à la production d’IL-18 lors de la HLH mais qu’il n’est pas essentiel au développement de la maladie dans le cadre des FHL. Par ailleurs, nous montrons que la cytotoxicité des cellules NK semble normale chez les patients atteints de SoJIA, ce qui suggère que les mécanismes immunologiques à l’origine de la HLH dans les FHL et dans les maladies autoinflammatoires comme la SoJIA sont distincts. Dans la seconde partie de ce manuscrit, nous avons étudié sur le rôle de la sérine/thréonine/tyrosine kinase Styk1 dans la régulation des lymphocytes cytotoxiques NK. Ces derniers sont responsables du contrôle immunitaire précoce des pathogènes intracellulaires et contribuent à l’immunosurveillance des cellules tumorales. Suite à leur activation, ils relâchent de très grandes quantités d’IFN-y et de TNF-α, faisant notamment le lien entre l’immunité innée et adaptative. La reconnaissance des cellules cibles par les lymphocytes NK est gouvernée par l’expression d’un éventail de récepteurs qui transduisent des signaux, activateurs ou inhibiteurs, et dont la balance se traduit par l’activation ou la tolérance. Ces récepteurs sont codés au sein de deux complexes génétiques très denses, le complexe de cytotoxicité naturelle (NCR) et le complexe des récepteurs des leucocytes (LRC). Au moment de commencer ces 4 travaux, nous avions révélé que l’expression de la kinase Styk1 fait partie de la signature transcriptionnelle des lymphocytes NK. Sa fonction dans le système immunitaire demeure toutefois inconnue. Néanmoins, la localisation génétique favorable de Styk1, près du NCR, ainsi que son implication dans la voie PI3K-AKT, en faisaient un candidat potentiel de régulation des lymphocytes NK. Afin de connaître le rôle de Styk1 dans le développement et les fonctions effectrices des lymphocytes NK, nous avons donc généré une souris pour laquelle Styk1 est invalidé. Nos résultats confirment que Styk1 est exprimée de façon spécifique par les cellules NK, et n’est pas retrouvée chez les autres types de cellules immunitaires, en particulier les cellules lymphoïdes innées (ILCs). Nous avons également détecté une diminution de l’activité constitutive de la voie AKT/mTOR dans les cellules NK, mais le développement, l’homéostasie et la fonction des cellules NK sont cependant normaux dans les souris déficientes en Styk1. 5 Role of the inflammasome and of Styk1 kinase in the regulation of cytotoxic lymphocytes Upon recognition of infected or target cells, CD8+ T and Natural Killer (NK) lymphocytes initiate a polarized degranulation of vesicle storing cytotoxic molecules (perforin: PRF1 and granzyme B). By altering the target cell’s cellular membrane integrity, perforine allows granzyme B to translocate to its cytosol. Genetic anomalies may affect normal cytotoxic functions and severely hamper the control of intracellular pathogens. In this context, the pathogenic signal remains uninterrupted and both cytotoxic lymphocytes and macrophages are continuously stimulated. This auto-inflammatory pathological condition is named hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) and is fatal without therapeutic intervention. HLH can also occur secondary to infection with viruses from the herpesviridae family, or be concomitant to important immune alterations such as systemic onset juvenile idiopathic arthritis (SoJIA), with no clear etiological cause identified. In 2014, a case of HLH mediated by the constitutive activation of the NLRC4 inflammasome receptor was first described. The inflammasome is a multimeric structure involving a cytosolic receptor, a scaffold protein – ASC – and Caspase-1. In the immune system, the inflammasome is expressed in macrophages and dendritic cells and senses pathogenic (PAMP) and danger (DAMP) associated signals. Once activated, inflammasome’s protein Caspase-1 catalyzes the maturation of pro-IL-1b and pro-IL-18 and leads to their secretion. Since NLRC4 constitutive activation appears to be sufficient for triggering HLH, we aimed to understand if the inflammasome structure was essential to the development of the syndrome. In order to address this question, we invalidated the inflammasome through the abrogation of ASC or Caspase-1 in PRF1 -/- HLH mouse model. We also tested the hypothesis that an altered cytotoxic function could explain the high prevalence of HLH in the proinflammatory context of SoJIA. The results we present here show that the inflammasome is responsible for the elevated levels of IL-18 in the serum of HLH patients. However, the inflammasome is facultative for its development. We also demonstrate that in patients suffering from SoJIA, NK cells show normal cytotoxicity, suggesting that immunological mechanisms involved in FHL and secondary HLH are distinct. In the second part of this manuscript, we aim at understanding the role of Styk1 serine/threonine/tyrosine kinase in NK cells’ regulation. NK cells are in charge of eliminating stressed, virally infected or transformed cells. Upon activation, they secrete large amounts of IFN-γ and TNF-α, thus bridging innate and adaptive immunity. Capabilities for recognition of target cells is endowed by the expression of numerous stochastically expressed activating and inhibitory receptors. The balance between activating and inhibitory signal allows for self-tolerance or activation upon engagement of abnormal cells. Activating and inhibitory receptor are germline encoded in two dense, large complexes, the Natural Killer Complex (NKC) and the Leukocyte Receptor Complex (LRC). At the moment of starting this work, we had recently identified that Styk1 was a signature transcript of NK cells. However, its function in NK cells and more generally in the immune system remains unknown. Nevertheless, its genetic localisation near the NKC and its potential implication in the PI3K-AKT pathway prompt that it may play a role in NK cell development and/or functions. In order to evaluate the role of Styk1 in NK cells’ regulation, we generated a mouse model in which its expression is abrogated. 6 Our data confirms that amongst all immune subsets, Styk1 is specifically expressed by NK cells. Styk1 was also able to discriminate NK cells from other ILCs. In this study, we show that Styk1 invalidation lead to a decrease of activity in the AKT/mTOR pathway. However, NK cells development, homeostasis and function were surprisingly normal in Styk1 -/- mice. 

Le système immunitaire

Le système immunitaire est constitué de deux sous-ensembles, les systèmes immunitaires inné et adaptatif (Figure 1). Le premier est basé sur la reconnaissance de patrons moléculaires associés aux pathogènes ou aux situations de danger, ce qui permet aux cellules de l’immunité innée de mettre en place une réponse généraliste mais rapide. Le second est un mécanisme plus complexe faisant intervenir l’éducation de cellules fonctionnelles suite au réarrangement somatique des gènes codant pour leurs récepteurs. Ce processus est générateur de diversité mais nécessite l’expansion clonale des lymphocytes qui sont spécifiques lors de la réponse immunitaire. En conséquence, le versant adaptatif du système immunitaire est plus lent lors de son déclenchement. Il permet toutefois de cibler une grande variété d’agents pathogéniques. Figure 1 : Représentation simplifiée du système immunitaire et de sa réponse Les cellules qui composent le bras inné du système immunitaire répondent rapidement mais de façon moins ciblée que les cellules de leur contrepartie adaptative. À l’inverse Les cellules de l’immunité adaptative ciblent très spécifiquement les pathogènes et persistent dans le temps. À l’interface, les lymphocytes Natural Killer, capables de mémoire mais exempts de mécanisme générateur de diversité. Inspiré de [1], tiré et adapté de [2]. 17 L’immunité innée L’identification des perturbations homéostatiques par les cellules de l’immunité innée est effectuée par des récepteurs reconnaissant des patrons moléculaires, les PRR. Ces derniers reconnaissent les patrons moléculaires qui sont associés aux pathogènes (PAMP) ou aux situations de danger (DAMP). Ces patrons moléculaires sont divers et les macrophages et cellules dendritiques (DC) expriment une myriade de PRR de différentes spécificités qui peuvent être membranaires ou encore cytosoliques [3]. Un des PRR importants de l’immunité innée est l’inflammasome. C’est un complexe multimérique de grand poids moléculaire permettant la reconnaissance de PAMP et de DAMP. Son activation mène à la maturation et sécrétion de l’IL-1β et de l’IL-18 [4]. La détection de signaux pathogéniques ou nonhoméostatiques par l’inflammasome repose sur un répertoire de senseurs cytosoliques de type NOD-like (NLR), notamment constitué de NLRP1, NLRP3 et NLRC4. L’inflammasome fait également intervenir les senseurs AIM2 et Pyrine [5]. Suite à l’activation des NLRs, ce qui a pour effet de révéler leurs domaines d’interaction, ces derniers s’associent avec la protéine échafaud ASC dont la structure contient un domaine pyrine (PYD) ainsi qu’un domaine de reconnaissance de la caspase (CARD). Il en résultera le recrutement éventuel de la pro-Caspase-1. La constitution de ce complexe induit le clivage de la proCaspase-1, son activation permettra à son tour de catalyser la maturation de la pro-IL-1β et de la pro-IL18, deux cytokines pro-inflammatoires. En parallèle, l’activation de la Caspase-1 catalyse également le clivage de la Gasdermine D, causant ainsi la pyroptose, un type de mort cellulaire spécialisée qui potentialise la réponse immunitaire en permettant notamment la relâche des cytokines (Figure 2).