ETUDE GENETIQUE

EXTRACTION

ADN DES TISSUS CANCEREUX

L’extraction de l’ADN total des tissus cancéreux a été effectuée avec la méthode Biobasics. Avec cette méthode, les tissus ont été morcelés afin de faciliter la digestion et mis dans 100 μl de solution ACL contenant des détergents qui entraînent une décomposition des tissus et un détachement des cellules. Un volume de 20 μl de protéase K a été ajouté au mélange pour dégrader toutes les protéines membranaires notamment les histones associées à l’ADN puis les tubes ont été incubés à 55°C dans un bain marie pendant une nuit. Après l’incubation nécessaire à la dégradation des protéines, le surnageant a été récupéré et les débris tissulaires éliminés puis 200 μl de solution AB ont été ajoutés au mélange, le tout vortexé et incubé à 70°C pendant 10 min. Ensuite, 200 μl d’éthanol 100 % froid ont été ajoutés au mélange afin de faire précipiter l’ADN puis vortexer vigoureusement pendant 20 secondes. Le lysat a été ensuite transvasé dans une colonne à membrane de silice préalablement placée sur un tube collecteur de 2 ml (fourni dans le Kit) ; et centrifugé à 13000 rpm pendant 3 min afin de retenir l’ADN chargé négativement au niveau membranaire de la colonne de silice chargée positivement. Ainsi, les protéines, les lipides et les polysaccharides ont été éliminés laissant apparaître un précipité au fond du tube. L’ADN obtenu est ensuite purifié pour éliminer toutes traces de contaminant. Après avoir vidé le tube collecteur, ce lavage a été réalisé par ajout successif de 500 μl de solution « Wash » dont le mélange a été centrifugé à 13000 rpm pendant respectivement 1 et 3 minutes. La dernière étape de l’extraction consistait à l’élution de l’ADN. Les colonnes ont été placées dans de nouveaux tubes eppendorf de 1,5 ml, puis 50 µL de tampon d’élution préalablement chauffé à 70°C afin d’augmenter le rendement de 15 à 20%, ont été ajoutés directement sur la membrane, suivie d’une incubation à température ambiante pendant 9 2 min pour la re-suspension de l’ADN et d’une centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 min. Cette dernière étape est suivie par le stockage de l’ADN à 4°C. 

ADN VIRAL

L’extraction de l’ADN viral a été effectuée à partir du sang des individus malades en utilisant le kit spécifique PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit. Pour cette méthode, nous avons deux étapes. La première étape consiste à la préparation du lysat et la seconde à la purification. Le protocole de préparation du lysat a été effectué en utilisant 200 μl de sang ajoutés à 25 μl de protéinase K dans un tube stérile. 200 μl de tampon de lyse ont été ensuite ajoutés puis le tout a été vortexé pendant 15 secondes suivie d’une incubation à 56° C pendant 15 minutes. Nous avons ajouté 250 μl d’éthanol à 100% dans le tube, fermé le couvercle et mélangé au vortex pendant 15 secondes. La dernière étape consiste à incuber le lysat pendant 5 minutes à température ambiante. Ceci étant fait, nous sommes passés à la purification de l’ADN viral. Nous avons débuté cette étape avec l’ajout du lysat à la colonne Viral Spin dans un tube de prélèvement suivi d’une centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 minute. Le tube de collecte est ensuite jeté pour ainsi placer la colonne dans un nouveau tube de lavage. Le lavage a été réalisé par ajout de 500 μl de tampon de lavage (WII) suivie d’une centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 minute. Cette étape a été répétée avec un temps de centrifugation de 3 minutes. Avant de procéder à l’élution, la colonne a été placée dans un tube Eppendorf. 50 μl de tampon d’élution ont été directement ajoutés sur la membrane de silice, suivie d’une incubation à température ambiante pendant 1 minute et d’une centrifugation à 13000 rpm pendant 1 minute. Le tube de récupération contient ainsi des acides nucléiques viraux purifiés. Les extraits d’ADN ont été conservés à 4°C. 

MIGRATION ELECTROPHORETIQUE DES EXTRAITS D’ADN

La qualité de l’ADN a été vérifiée par migration électrophorétique qui consiste à séparer les fragments d’ADN en fonction de leurs tailles par migration dans une matrice solide de gel d’agarose soumis à un champ électrique. En effet, 7 μl de chaque extrait d’ADN plus 3 μl de bleu de bromophénol ou bleu de charge ont été déposés dans des puits sur un gel d’agarose de 1,5 % puis migrés à 100 Volts pendant 30 min. Le gel d’agarose a été préparé avec 1,5 gramme d’agarose que l’on ajoute à 100 ml de solution TAE 0,5X. Après migration, les extraits d’ADN ont été révélés dans une chambre noire sous UV après passage dans un bain de Bromure d’Ethidium (BET). La taille des extraits d’ADN a été approximativement évaluée à l’aide d’un poids moléculaire à pas de 200 paires de bases. 

AMPLIFICATION EN CHAINE PAR POLYMERASE ET SEQUENÇAGE DE LA D-LOOP, DU MTCYB ET DE MY09/11

Dans cette étude deux marqueurs mitochondriaux à savoir le MT-CYB et la D-Loop ont été choisis pour faire la caractérisation moléculaire du cancer de la cavité buccale. Dans le but de rechercher 10 la présence et les différents sérotypes des HPV chez nos patients une partie du gène L1 a été amplifiée et séquencée en utilisant le couple d’amorces (MY09/11).  le MT-CYB, une région de plus d’un millier de paires de bases du génome mitochondrial située entre les positions 14747 et 15887 dans la séquence humaine (Anderson, 1981), appartient à un des quatre complexes qui assurent le transfert des électrons dans la chaîne respiratoire mitochondriale. Il est la seule des 11 sous unités du complexe cytochrome c oxydoréductase (complexe III ou complexe cytochrome bc1, CE 1.10.2.2) à être codée par l’ADNmt (Iwata et al., 1998 ; Legros et al., 2001). Il forme avec le cytochrome c1 et la protéine Rieske de sulfure de fer, le noyau catalytique du complexe enzymatique cytochrome bc1. Ainsi, des changements importants dans sa séquence d’acides aminés auraient donc une forte probabilité d’induire une modification de la fonction catalytique de ce complexe III. Par conséquent, des mutations du MT-CYB affectant sa structure, pourraient être l’un des facteurs de causalité du développement tumoral. C’est ce qui justifie en fait son choix pour cette étude.  l’autre gène mitochondrial étudié est la D-Loop. Concernant son choix, il est basé sur le fait qu’elle présente beaucoup d’intérêts car étant la seule région non codante de l’ADNmt. Elle contient l’origine de réplication du brin lourd et les sites d’initiation de la transcription et de la réplication (Larsson et Clayton, 1995).  la protéine L1 est la protéine majeure de la capside (80% de la capside) hautement conservée entre les papillomavirus (Monsonego, 2006). Elle est nécessaire et suffisante à elle seule pour construire une capside synthétique identique à la capside naturelle (Bishop et al., 2007), par la formation des pseudo-particules virales (virus Like-Particles VLP). Ces dernières présentent une morphologie et des propriétés antigéniques similaires à celles des virions natifs. Cette protéine a la propriété de se lier aux récepteurs cellulaires et porte les épitopes conformationnels responsables de l’induction des anticorps neutralisants spécifiques (Muñoz, 2006 ; Alain et al., 2010) Le MT-CYB et la D-Loop ont été amplifiés à partir de l’ADN des tissus et le gène L1 a été amplifié à partir de l’ADN viral. Pour la recherche des HPV nous avons utilisé lors des amplifications des extraits d’ADN des patientes positives au cancer du col de l’utérus comme témoins positifs. Les amplifications ont été réalisées dans un thermocycleur de marque Eppendorf et dans des conditions décrites dans le tableau I. Les séquences des oligonucléotides utilisées sont également consignées dans le tableau I. Une migration électrophorétique a été effectuée à la fin de chaque amplification à partir de 5 μl du produit PCR et de 3 μl de bleu de bromophénol. Les produits PCR positifs ont été purifiés et séquencés avec l’amorce sens. Les réactions de séquençage ont été effectuées dans un 11 thermocycleur de type MJ Research PTC-225 Peltier avec le Kit ABIPRISM et soumises à une électrophorèse dans le séquenceur ABI 3730 XL.