La chambre de culture climatisée (SANYO MLR-351H Versatile Environmental Test Chamber) 

La chambre climatique SANYO (SANYO Electric Co., Ltd., Japan) permet précisément de contrôler et reproduire une grande gamme de température, d’humidité et des cycles d’éclairages nécessaires dans les études de recherche. La chambre peut être utilisée dans de multiples domaines: – La croissance des plantes – La culture des cellules, des tissus et des organes végétales – L’incubation et la croissance des insectes – Les tests électroniques – Les tests alimentaires – Les tests de conditionnement Cette chambre représente (i) un écran LCD permettant un affichage visuel de l’opération, (ii) un fonctionnement plus facile et intuitif, (iii) une fonction programmée de la température, de l’humidité et de l’éclairage, (iv) un microprocesseur PID pour contrôler la température et l’humidité, (v) un capteur d’humidité de type membrane moléculaire élevée, (vi) un calibrage facile et une fonction d’enregistrement des données. La programmation de la lumière et l’humidité est possible par cycle temps/température De multiples programmes peuvent être connectés, et les fonctionnements de départ du jour et de l’heure peuvent être programmés. Le microprocesseur PID de contrôle de la température et de l’humidité (de 0 à 50 °C, de 0 à 20000 lux et de 55 à 90 % d’humidité relative (RH)) permet la création d’environnements optimaux utiles dans différentes type d’applications. Les données opérationnelles de 2 semaines (intervalles de 6 minutes) peuvent être automatiquement enregistrées, visualisées sur le panneau de commande et également transmises à un PC via RS-232C et une carte d’interface (MTR- 480). ANNEXE II 218 Figure

La chambre de la culture SANYO MLR-351H 

Spectrophotomètre visible à balayage (biochrom UV/Visible Libra S22)

 Le spectrophotomètre biochrom Libra S22 (Biochrom Ltd., UK) permet de réaliser des mesures en absorbance pour les analyses biochimiques. Ce spectrophotomètre permet d’enregistrer les courbes d’étalonnage, de réaliser des balayages de spectres et des suivis de cinétique d’absorbance. Tous les graphiques et les courbes affichées peuvent être imprimés. Une connexion à un PC est assurée pour une acquisition et un transfert des données sur Excel. Le logiciel d’acquisition possède une option pour des applications avancées et une manipulation plus aisée. Des équations paramétrables sont programmables en mode multilongueurs d’onde et 18 méthodes peuvent être sauvegardées en mémoire. Il détecte une gamme spectrale de 330 à 800 nm, et en utilisant des cuves standards (10 mm). ANNEXE II 219 Figure 2. Spectrophotomètre biochrom Libra S22

Le Lecteur de microplaques à absorbance (PowerWave HT) 

Le lecture de microplaque (Power Wave, HT microplate spectrophotometer, BioTek, France) est un spectrophotomètre visible à balayage permettant de réaliser des mesures d’absorbance, et des cinétiques à plusieurs longueurs d’ondes. C’est un monochromateur détectant les longueurs d’onde continues de 200 à 999 nm avec une capacité de lecture de 96 puits (1 cm) sur microplaque, avec trois vitesses de lecture, un mode balayage et un contrôle de la température de 4 °C à 50 °C assurant une uniformité de la température nécessaire pour les mesure en cinétique. Cet appareil est équipé d’une lampe à xénon pour les mesures d’absorbance en UV et également en lumière visible. Le temps de lecture d’une plaque dépend à la méthode de lecture. Le mode balayage est le plus rapide des trois modes. La vitesse réelle de lecture peut aussi varier en fonction de la longueur d’onde sélectionnée. Chaque longueur d’onde a une localisation unique dans le monochromateur, et les autres localisations nécessitent des durées variables de temps à positionner. ANNEXE II 220 Figure 3. Le lecteur de microplaque PowerWave HT 

L’électrode de Clark 

Le taux de transfert des électrons a été déterminé par polarographie à la température de la pièce en mesurant l’oxygène dégagé ou consommé grâce à une électrode de Clark (Oxygraph système DW1, Hansatech Instruments, Norfolk, UK). Le signal émis lors du changement de la concentration en oxygène dans la chambre réactionnelle est transmis par l’oxygraphe à un logiciel qui permet de suivre ces évolutions et d’exprimer les modifications de concentrations d’oxygène en (nmol μg-1 chlorophylle min-1 ). Le principe de cette technique réside dans l’application d’une différence de potentiel de 0,7 V entre l’anode (en argent) et la cathode (en platine) reliées par une petite couche d’électrolyte (KCl 50 % saturé). Cela permet à l’oxygène présent dans la solution d’être ionisé en hydroxyle au contact de la cathode suivant la réaction ci-après: O2 + 2 H2O + 4 e− 4 OH− Cette réaction génère un très faible courant proportionnel à la concentration en O2 contenu dans l’échantillon de chloroplastes intacts ou de thylakoïdes. Par la suite, ce courant est amplifié et mesuré. Un thermorégulateur est relié à la chambre réactionnelle afin de limiter les variations de température, qui pourrait fausser la mesure car la concentration en O2 d’une solution dépend de la température. La température a ainsi été maintenue stable à 25 °C pendant toutes les étapes de manipulations. Les échantillons ont été éclairés avec une lumière blanche continue. Le flux de photons (PAR) est de 500 à 1000 μmol m −2 s −1 . Le milieu d’analyse est une cellule cylindrique au volume final de 1 mL. L’hydrosulfite de sodium (Na2S2O4) a été utilisé pour obtenir une solution exempte d’oxygène et ainsi obtenir le zéro de l’appareillage selon la réaction suivante: ANNEXE II 221 Na2S2O4 + O2 + H2O NaHSO4 + NaHSO3 De l’eau saturée en oxygène, obtenue grâce à un bullage d’air permet d’obtenir la valeur de 100 % d’oxygène. On introduit un agitateur magnétique afin d’assurer une bonne homogénéisation de la solution. La concentration de chlorophylle des échantillons mesurés dans la chambre réactionnelle était de l’ordre de 80 μg mL −1 . En effet, la teneur en chlorophylle ne doit pas dépasser 100 μg mL −1 parce que de grandes quantités de chloroplastes actifs peuvent produire de l’O2 à des taux assez élevés, ce qui conduit à la formation de bulles et fausse les résultats. Figure 4. Électrode d’oxygène de Clark ANNEXE II 222 

Handy-PEA 

Le Handy-PEA (Plant Effeciency Analyser, Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK) effectue des mesures de cinétique rapide de la fluorescence chlorophyllienne sur des périodes de temps courtes. Le signal de la fluorescence chlorophyllienne reçu par le capteur au cours de l’enregistrement est numérisé à l’intérieur de l’unité de commande. Ce signal numérisé est sauvegardé à des vitesses différentes dépendant des différentes phases de la cinétique d’induction. Initialement, les données sont présentées à des intervalles de 10 µs à 0,3 ms. Les données enregistrées sont de 100 kHz avec 12 bit (0-4095 bits) de résolution. La lumière est fournie par trois LEDs ultra-lumineuse rouge, optiquement filtrée pour une longueur d’onde de 650 nm facilement absorbé par les chloroplastes, avec une intensité lumineuse maximale de 3500 µmol m −2 s −1 à la surface de l’échantillon. Le détecteur est une photodiode PIN à haute performance avec un filtre RGs. Ce filtre empêche la lumière rouge émise par les LEDs d’atteindre le détecteur de fluorescence. Les échantillons peuvent être adaptés à l’obscurité par l’utilisation des pinces à feuilles (leafclips de 4 mm de diamètre). La lumière est concentrée par des lentilles pour assurer un éclairage uniforme via la pince sur la surface de feuille. Jusqu’à 1000 enregistrements allant de 0,1 à 300 secondes peuvent être sauvegardés dans la mémoire de l’Handy-PEA. Ces données enregistrées avec les paramètres calculés peuvent être visualisées en format numérique à l’écran de l’Handy-PEA ou transférées via le logiciel de transfert et d’analyse des données de Windows.